[發明專利]趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關的SNP標記及其應用

有效

• 申請號: 201310082332.4
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN104046623A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 李寧;陳志勝;任立明;胡曉湘
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關的SNP標記及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），俗稱“藍耳病”是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的，該病毒是巢狀病毒目動脈炎病毒科的一個成員，同屬的病毒還有馬動脈炎病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現為間質性肺炎和母豬流產木乃伊胎等，每年對全世界的養豬業造成了巨大的經濟損失。2007年在中國爆發了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴散，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死亡，該病最后證實是由一種高致病性的藍耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞，現在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應答，體液免疫不能及時產生有效的中和抗體，而且會形成抗體依賴的病毒增強效應，最終導致免疫抑制和持續感染，由于該病毒的突變率極高，傳統疫苗方法也不能有效控制該病，很多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補傳統方法的不足。

由于不同的豬品種和個體的遺傳背景差異，對藍耳病的抗性也不同，研究表明在臨床癥狀和生理生化指標上，通城豬、梅山豬等國內豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感染高致病性PRRSV后有較強的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和通城豬的組織做差異基因表達分析，某些免疫相關的基因表達量在感染前后兩個品種間有顯著的差異。另外，存在一些品種間的SNP位點，這些基因在宿主的免疫應答中起到了很重要的作用，而且這些SNP位于基因的外顯子中，通過找出不同品種間PRRSV感染造成的基因表達差異，不僅可以研究PRRSV的感染機制，還可以找出抗性或易感相關的基因，通過對品種間的SNP進行比較分析，從而篩選出抗性較強的豬。

發明內容

本發明的目的是提供趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關的SNP標記及其應用。

CXCR3是一種趨化因子受體，可結合CXCL9、CXCL10、CXCL11，可以調節白血球細胞的轉運。當這些趨化因子和CXCR3結合后可以促進引起一系列細胞應答，如細胞骨架的改變，趨化運動等，還可以吸引Th1細胞，促進Th1細胞的成熟，在傷口的愈合中也起到一定的作用，本發明人首次發現在兩個不同抗性的豬品種：長白豬（易感豬）、通城豬（抗病豬）之間的趨化因子受體CXCR3基因外顯子中存在兩個品種間SNP位點，用常規分子生物學方法檢測這兩個位點的堿基類型，可以作為一種檢測抗病和易感豬的方法。

為了實現本發明目的，本發明提供一種與豬抗藍耳病相關的SNP標記，其位于豬的趨化因子受體CXCR3基因上，所述SNP標記的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其中，該序列的171bp和279bp兩處堿基為T的待測豬為易感藍耳病豬品種，而該兩處堿基分別為G和C的待測豬為抗藍耳病豬品種。

本發明還提供用于檢測與豬抗藍耳病相關的SNP標記的引物對，其包括上游引物F：5’-CGCTCCCAGACTTCATCTTC-3’和下游引物R：5'-GAGGCAGTCACCTCTGAAGC-3'。

本發明還提供與豬抗藍耳病相關的SNP標記在鑒定抗藍耳病豬品種中的應用，其包括步驟：1）提取待測豬樣品組織中的總RNA，反轉錄成cDNA；2）以步驟1）中的cDNA為模板，F和R為引物，進行RT-PCR反應；3）分析PCR產物，如果擴增產物序列中171bp和279bp兩處的堿基為C，則待測豬為抗藍耳病豬品種。

反轉錄PCR的步驟為：

i）打開RNA二級結構

在一支無核酸酶污染的小離心管中加入：

RNA??????????????????2μg

oligodT??????????????1μg

無核酸酶水補齊至?????15μl

加熱離心管至70℃，5分鐘。

ii）反轉錄PCR

向上述離心管中加入：

反轉錄PCR的反應條件為：42℃，60min。

常規PCR使用的擴增體系以15μl計為：

常規PCR的反應條件為：：95℃?5min；以95℃?30s，50℃-70℃，30s-2min；72℃30s-2min做35個循環；72℃10min，于4℃保溫。