[發明專利]基于甘露糖受體MRC-1基因的表達量篩選抗藍耳病豬的方法

有效

• 申請號: 201310082310.8
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN104046684A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 李寧;陳志勝;任立明;胡曉湘
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及抗藍耳病豬的分子生物學檢測技術，具體地說，涉及一種基于甘露糖受體MRC-1基因的表達量篩選抗藍耳病豬的方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），俗稱“藍耳病”是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的，該病毒是巢狀病毒目動脈炎病毒科的一個成員，同屬的病毒還有馬動脈炎病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現為間質性肺炎和母豬流產木乃伊胎等，每年對全世界的養豬業造成了巨大的經濟損失。2007年在中國爆發了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴散，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死亡，該病最后證實是由一種高致病性的藍耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞，現在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應答，體液免疫不能及時產生有效的中和抗體，而且會形成抗體依賴的病毒增強效應，最終導致免疫抑制和持續感染，由于該病毒的突變率極高，傳統疫苗方法也不能有效控制該病，很多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補傳統方法的不足。

由于不同的豬品種和個體的遺傳背景差異，對藍耳病的抗性也不同，研究表明在臨床癥狀和生理生化指標上，通城豬、梅山豬等國內豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感染高致病性PRRSV后有較強的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和通城豬的組織做差異基因表達分析，某些免疫相關的基因表達量在感染前后兩個品種間有顯著的差異。通過對不同品種間PRRSV感染造成的基因表達差異的分析，不僅可以研究藍耳病的感染機制，還可以找出抗性或易感相關的基因，從而為藍耳病的治療和預防提供新辦法。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于甘露糖受體MRC-1基因的表達量篩選抗藍耳病豬的方法。

甘露糖受體（MRC-1）是一種位于巨噬細胞或樹突狀細胞表面的C-型凝集素，它可以識別病原表面的甘露糖，激活補體途徑。該受體通過識別糖蛋白表面的碳水化合物參與許多生物學過程，包括細胞互作，巨噬細胞吞噬等。本發明人首次發現在兩個不同抗性的豬品種：長白豬（易感豬）、通城豬（抗病豬）感染PRRSV后，甘露糖受體（MRC-1）基因受到了不同的調控，從而可以通過檢測該基因的表達來預測豬的抗病性。

為了實現本發明目的，本發明提供一種用于檢測甘露糖受體MRC-1基因的特異性PCR引物對，其包括：

上游引物MRC-1-F：5′-GGCGTGTCCACTTACCACAA-3′和

下游引物MRC-1-R：5′-TTGCCTATGAGATCTTTCGTGTCA-3′。

本發明還提供一種篩選抗藍耳病豬的方法：通過檢測豬體內甘露糖受體MRC-1基因的表達量來篩選抗藍耳病豬品種，抗藍耳病豬品種在感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒后（例如感染PRRSV5天后），豬體內甘露糖受體MRC-1基因的表達量上調。

優選通過熒光實時定量PCR檢測感染PRRSV前后（即感染第0天、感染第5天）豬體內甘露糖受體MRC-1基因的表達量。熒光實時定量PCR使用的引物為：

目的基因MRC-1：

上游引物MRC-1-F：5′-GGCGTGTCCACTTACCACAA-3′

下游引物MRC-1-R：5′-TTGCCTATGAGATCTTTCGTGTCA-3′；以及

內參基因RPL32：

上游引物RPL32-F：5′-CAACAAGAAAACAAAGCACATGCT-3′

下游引物RPL32-R：5′-GCGGTTCTTGGAAGAGACGTT-3′。

熒光實時定量PCR檢測步驟為：

1）提取待測豬樣品組織中的總RNA，反轉錄成cDNA；

2）以步驟1）中的cDNA為模板，分別以MRC-1-F和MRC-1-R、RPL32-F和RPL32-R為引物，進行熒光實時定量PCR反應；

3）分析PCR產物。

熒光實時定量PCR反應體系為：

熒光實時定量PCR反應條件為：在ABI7300熒光實時定量PCR儀上進行反應，熒光實時定量反應程序模板設置為ddCt?Plate，反應循環參數設置為：55℃5min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40個循環；采用相對定量2^-△△CT法計算相對表達量。