[發明專利]轉基因大豆MON89788轉化事件的檢測方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201310080635.2
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103409498A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 于常海;楊濱;張明;李飛武;劉樂庭
• 申請（專利權）人: 海康生物科技(北京)有限公司;吉林省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及轉基因植物檢測領域，特別涉及用于檢測生物樣品中是否存在轉基因大豆MON89788轉化事件的方法和試劑盒。?

背景技術

在農業或工業上通過遺傳操作成功地向植物中引入在商業上感興趣的性狀是一個依賴不同因素的復雜過程。根據國際農業生物工程應用技術采集管理局(ISAAA)統計，自轉基因產品商品化以來，轉基因農作物的種植面積已經超過了10億公頃。而中國成為第六大轉基因作物增長國。隨著各國對轉基因產品的管理和人們對轉基因產品安全性的關注，世界各國紛紛出臺相關法規政策，要求對轉基因產品進行標識。?

轉基因大豆MON89788品系經過改造后，是可以抗Roundup除草劑中的活性成分-草甘膦的一種轉基因品系。抗草甘膦的大豆是通過在其基因組內插入草甘膦抗性的元件——烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因而起到抗除草劑的性狀，此酶是從土壤農桿菌菌株CP4中分離出來的，簡稱CP4EPSPS。EPSPS是草莽酸途徑中的一個重要的酶，這個途徑參與了植物芳香類物質以及芳香族氨基酸的合成。草甘膦通過抑制EPSPS活性阻斷芳香族氨基酸的合成，最終導致受試植株的死亡。從土壤農桿菌菌株CP4中分離出來的CP4-EPSPS，具有抗草甘膦的特性。而在哺乳動物體內沒有合成芳香族氨基酸的途徑，所以這種酶對人體無害。?

MON89788型轉基因大豆是由美國孟山都公司開發成功的。MON89788大豆已大面積種植并在市面上流通。但由于生物安全性的考慮，以及各國法律的相關規定，要求對含這種轉基因大豆成分的產品在標簽中予以注明，以具有可追溯性。?

馬爾文等發表了關于大豆事件MON89788和檢測它的方法(中華人民共和國知識產權局.公開號：CN101252831A.公開時間：2008年8月27日)。所述方法基于PCR檢測技術，通過測定MON89788外源DNA區與5’或3’側翼區的連接區域(轉化體特異性檢測)的存在來確認轉基因事件MON89788的存在。上述檢測方法需要依賴昂貴的儀器，并且，由于其擴增產物為DNA，為了防止DNA造成的實驗結果相互污染的問題，在設計實驗室場地時，常需要將樣品提取、樣品擴增和樣品檢測分布到不同的房間，并且需要嚴密謹慎小心的操作，這就增加了試驗的復雜性。因此，需要開發一種高效、準確、靈敏且簡便的檢測方法。這對于國家的進出口貿易、轉基因安全性以及對于海關、商檢、出入境檢驗檢疫部門、食品加工部門來說都是至關緊要需要解決的一個問題。?

發明內容

本發明提供了一種檢測轉基因大豆MON89788轉化事件的方法，該方法包括以下步驟：?

(a)將樣品DNA95℃變性后立即冰置，使用特異性識別MON89788外源DNA區的特異引物對，在RNA聚合酶的作用下轉錄生成RNA；所述引物之一包含所述RNA聚合酶的識別序列；?

(b)使用上述特異引物對，對上述所得RNA進行NASBA擴增，得RNA擴增產物；?

(c)分別設計捕獲探針和檢測探針，對上述RNA擴增產物進行檢測。?

所述“外源DNA區”是相對于受體植物內源性DNA區的概念，包括MON89788的植物基因組中側翼于TDNA(包含轉基因的轉化DNA)插入的5’末端的基因組DNA的一部分。所述MON89788外源DNA區具有SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列。?

在具體實施例中，所述RNA聚合酶為T7RNA聚合酶，所述T7RNA聚合酶的識別序列為SEQ?ID?No.2所示的T7promoter序列。?

本發明所述引物對優選引物長度為18-28bp，GC含量為30％-40％，擴增長度為120-450bp，Tm值在57-62攝氏度的引物對。?

優選地，所述引物對分別包含SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示核苷酸序列，特異性識別MON89788外源DNA區內的5’末端基因組序列。?

在具體實施例中，所述引物對分別為如SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示的核苷酸序列。SEQ?ID?No.5所示序列的5’端含有與捕獲探針序列具有至少90％相似性的核苷酸序列；SEQ?ID?No.6所示序列的5’端包含T7RNA聚合酶的識別序列。?