[發明專利]一株穩定高產2,3-丁二醇的細菌及利用低溫等離子體和硫酸二乙酯復合誘變的方法

有效

• 申請號: 201310080237.0
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103275886A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 戴建英;程小龍;修志龍
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12N13/00;C12R1/01
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

技術領域

本發明屬于微生物誘變育種技術領域，涉及到使用低溫等離子體和硫酸二乙酯復合誘變產生一株高產2,3-丁二醇的菌株及其應用。

背景技術

2,3-丁二醇（2,3-Butanediol，2,3-BD）是一種非常重要的化工原料及燃料，在醫藥、食品、精細化工等領域有廣泛用途。由于2,3-丁二醇含有兩個手性中心，化學合成困難，所以以生物質資源為原料、經微生物法生產2,3-丁二醇具有很大的工業化前景，其中如何獲得高產2,3-丁二醇的菌株對于生物法生產2,3-丁二醇的工業化具有重要意義。

目前發酵生產2,3-丁二醇的微生物主要是細菌類，包括克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、芽孢桿菌（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單孢桿菌屬（Pseudomonad）等。目前肺炎克雷伯氏桿菌發酵獲得的2,3-丁二醇產物濃度最高，也是研究最多的菌種。但此菌屬于條件致病菌，作為一種工業應用菌種具有很大的局限性和不安全性。

近年來，國內外對2,3-丁二醇的發酵的研究很多，主要圍繞著菌種的誘變篩選和基因工程改造等。最常用的誘變方法有紫外誘變、化學誘變或兩者的結合。紫外誘變雖然安全，但是操作復雜，而且誘變效率低。化學誘變的效果較好，但是一般作用時間長，毒副作用大。

低溫等離子體是一種低溫非平衡等離子體，是指氣體在大氣壓下受到外界高能量(高電壓、強電磁場、輻射等)作用時氣體分子被擊穿，產生帶電粒子、自由基、活性物質和紫外線等，且整個體系呈現低溫狀態。低溫等離子處理細胞時能夠破壞細胞壁，可以使大量帶電粒子、活性物質和紫外線能夠進入細胞直接作用于胞內核酸，同時這也使化學分子能更有效地直接作用于DNA上，減少了處理時間。

本發明使用低溫等離子體和硫酸二乙酯復合誘變的方法對微生物進行誘變育種。該方法中使用的硫酸二乙酯用量低，在空氣中暴露時間短，不僅保證了化學誘變的高效性，同時增加了操作人員的安全性。采用的復合誘變方法操作簡單易行、效率高，復合誘變大大降低了突變菌的回復率，保證了突變菌的穩定性。

發明內容

本發明內容在于使用一種新型的誘變方法—低溫等離子體和硫酸二乙酯復合誘變法處理微生物，選育一株穩定高產2,3-丁二醇的突變菌株及該菌株在發酵生產2,3-丁二醇中的應用，解決工業生產中生產安全和發酵液2,3-丁二醇濃度低的問題，為2,3-丁二醇的工業生產及應用奠定基礎，同時也為其他微生物的誘變選育提供了一種新的誘變方法。

本發明提供了一種行之有效的誘變育種新技術。以Enterobacter?cloacae（陰溝腸桿菌）或其他細菌為原始菌株，首先使用硫酸二乙酯預處理原始菌株，然后使用低溫等離子體處理含有硫酸二乙酯的菌懸液進行復合誘變，最后通過多重篩選得到穩定高產的突變菌株。

本發明的技術方案如下：

一株穩定高產2,3-丁二醇的細菌，其分類命名為Enterobacter?cloacae?DLM，已于2012年4月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，其保藏號為：CGMCC6053。

上述細菌利用低溫等離子體和硫酸二乙酯復合誘變的方法，包括如下步驟：

（1）將原始菌株進行硫酸二乙酯預處理

將菌種以1-2%接種量接入種子培養基中，培養12-16h后，取菌液離心，棄上清液，殘留菌體用無菌生理鹽水稀釋至細胞個數為10⁷-10⁹/mL。向菌懸液中加入1-3%（v/v）的硫酸二乙酯進行振蕩混合，處理時間為3-10min。

（2）復合誘變菌株

采用介質阻擋放電（DBD）裝置。取500uL硫酸二乙酯預處理過的菌懸液滴加到直徑60mm的滅菌冷卻后玻璃圓盤的中央，置于等離子體誘變平臺中。調節玻璃圓盤上部的高壓電極與菌液液面的間隙，調節電流和電壓，使氣體產生放電，得到均勻的空氣介質阻擋放電等離子體，放電處理15-160s。將此菌懸液稀釋涂于平板培養基上，將平板置于25～37°C恒溫培養箱中培養，培養時間為1～2天。計數平板上的菌落數，得出致死率，從而確定最佳誘變時間，誘變時間一般選擇致死率約為70%左右的時間點。

（3）菌種篩選