[發明專利]多對二硫鍵定點環化固相合成多肽新工藝

無效

• 申請號: 201310079963.0
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103214550A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 王錫平
• 申請（專利權）人: 蘇州強耀生物科技有限公司
• 主分類號: C07K1/06
• 分類號: C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及多肽合成領域，更具體地說，本發明涉及一種多對二硫鍵定點環化固相合成多肽新工藝。

背景技術

多肽傳統的氧化方法是在樹脂上把序列合成完后，用酸把產物裂解下來，然后用空氣氧化或者DMSO氧化，或者雙氧水或者典等氧化的方法。傳統氧化方法存在以下缺點：空氣氧化和DMSO氧化缺點是溶劑體積太大，氧化時間過長，一般是1mg產物對1毫升的溶劑，最后都要有幾百毫升的體積，氧化好后還要去除溶劑然后再純化。而且這兩種多肽氧化方法耗時很長，一般氧化用時2天左右，除溶劑也要兩天左右。所以在整個生產過程中，氧化這一步驟就要占用很大的比例。雙氧水或者碘氧化的方法雖然用時比較短，但是都有局限性，序列中如果含有甲硫氨酸或者天門冬氨酸就不能用雙氧水這種強氧化劑氧化，而且他對溶劑的酸堿度等也有要求。碘氧化步驟比較繁瑣而且產率不高，氧化后要馬上處理否則樣品會有變的可能性。二硫鍵環化多肽也有固相環化的方法，既一般是用特殊的巰基保護基(比如ACM，MMT等)在多肽序列合成完后用特殊物質去除巰基的特殊保護，然后在樹脂上氧化，這樣的好處是氧化完成后直接切割拿到的產物就是所需要的最終產物，節約了大量的人力物力。上述的方法大部分只能合成單個二硫鍵的環化，對于目前比較復雜的多對二硫鍵的多肽的合成則沒有什么優勢，本發明涉及多對二硫鍵的定點環化固相合成多肽的新工藝。其中運用了低成本環保的單保護的多肽二硫鍵環化固相技術和傳統的特殊巰基保護基的二硫鍵環化技術。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種提高工作效率、降低了原料成本和人工成本的多對二硫鍵定點環化固相合成多肽新工藝。

本發明的目的是通過下述技術方案實現的：

一種多對二硫鍵定點環化固相合成多肽新工藝，所述的新工藝亦稱樹脂上氧化工藝，所述的新工藝按如下具體步驟如下：

第一步，由于需要多對二硫鍵，所以適宜的多肽序列含有四個以上半胱氨酸殘基，將要配對的半胱氨酸殘基進行編號；

第二步，將配對的半胱氨酸殘基選擇一對用單保護的半胱氨酸，一對用H-Cys(Acm)-OH，一對用H-Cys(MMT)-OH；

第三步，應用多肽固相合成技術將多肽序列固定在固相載體上，其中對應的半胱氨酸殘基采用單保護或者用H-Cys(Acm)-OH或者用H-Cys(MMT)-OH；

第四步，序列合成完成后，將樹脂載體浸泡在有機溶劑中，然后添加氧化劑，將序列中兩個單保護的半胱氨酸殘基的-SH氧化，形成二硫鍵；

第五步，用砂芯濾柱過濾掉溶劑，用純DCM和DMF清洗樹脂；

第六步，將樹脂加入含有1％的脫除劑的有機溶劑的容器中，進行其中兩個半胱氨酸殘基保護基的特異性去除；

第七步，用砂芯濾柱過濾溶劑用ELLMAN試劑檢測，用純DCM和DMF清洗樹脂；

第八步，將樹脂載體浸泡在有機溶劑中，添加氧化劑，將已去除-HS保護基的兩個半胱氨酸殘基的-SH氧化，形成二硫鍵；

第九步，用砂芯濾柱過濾掉溶劑，用純DCM和DMF清洗樹脂；

第十步，用ELLMAN試劑檢測，查看反應是否完全，對比本發明和常規工藝的兩對二硫鍵氧化肽合成的優劣。

與現有技術先比，本發明具有以下有益效果：

節省時間、提高工作效率、降低了原料成本和人工成本。

具體實施方式

下面將通過實施例對本發明的實質性內容作進一步的詳細描述：

經過實驗驗證本氧化方法在多肽固相有機合成中的實用性、有效性和先進性。

實施例：

合成一條序列為DKCYGLACASCEFEPCLL的肽，序列中兩端兩個半胱氨酸之間形成一對二硫鍵，中間兩個半胱氨酸之間形成一對二硫鍵。原理：通過載體固定序列的羧基端，按照順序合成，待合成完序列后在把序列從載體上裂解下來之前，讓序列中兩個半胱氨酸上的巰基通過一定的技術手段形成二硫鍵，并計算收率。

準備工作：配置茚三酮檢測試劑20ml，20％的六氫吡啶脫帽液，DMF，DCM，甲醇，配置好的三氟乙酸裂解液。

其它原料：Fmoc-Leu-wang樹脂，HBTU，DIEA，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Cys-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Ser(Tbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-Cys