[發(fā)明專利]用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310079950.3
• 申請(qǐng)日: 2013-03-13
• 公開（公告）號(hào): CN103143332A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 殷宏;羅建勛;李有全;張曉;劉志杰;陳澤;楊吉飛;關(guān)貴全;任巧云;劉愛紅;牛慶麗;劉軍龍;馬米玲;岑雙慶;何海寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): B01J20/291
• 分類號(hào): B01J20/291;B01J20/30;B01D15/00;C12N1/10;C12R1/90
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱及其制備方法。

背景技術(shù)

羊泰勒蟲病（Ovine?and?caprine?theileriosis?）是由媒介蜱傳播的由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的疾病的總稱。羊泰勒蟲病最早在1914?年發(fā)現(xiàn)于埃及綿羊。我國最早在1958?年由楊輔國等報(bào)道了四川的羊泰勒蟲病，隨后在青海、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西和寧夏等地也有本病流行的報(bào)道。最近，在我國湖北、廣東、浙江、貴州、新疆等省也檢測(cè)到羊泰勒蟲病原體。本病主要呈地方性流行，發(fā)病率高達(dá)36.0%-100%，病死率高達(dá)17.8%-75.4%。該病危害嚴(yán)重，可引起羔羊和外地引進(jìn)羊大量死亡，使慢性發(fā)病的山羊和綿羊發(fā)育遲緩，產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，從而給全球養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

羊泰勒蟲裂殖子的分離純化一直是造成許多相關(guān)研究停滯不前的重要原因，任何非蟲體來源的物質(zhì)都有可能對(duì)其研究產(chǎn)生嚴(yán)重偏差，例如，羊泰勒蟲蛋白質(zhì)組全譜分析、差異蛋白分析與研究、轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)研究等，這都對(duì)羊泰勒蟲的分離純化技術(shù)提出了更高的要求。

目前，國內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)建立了一些分離微小寄生蟲的方法，例如，利用纖維素濾膜過濾法純化弓形蟲速殖子（方正明，2010），雖然能分離到較純凈的蟲體，但回收率太低，且存在濾膜易破、分離量少等缺點(diǎn)。Sugimoto等用溶血素法裂解感染瑟氏泰勒蟲的牛紅細(xì)胞，再通過Percoll?密度梯度離心來回收牛瑟氏泰勒蟲，雖然可以大量的純化蟲體，但純化產(chǎn)物中往往混有較多雜質(zhì)，并且蟲體易破損，造成蛋白損失，嚴(yán)重影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。利用溶血素從感染紅細(xì)胞分離羊泰勒蟲裂殖子（李有全，2007），雖然純化效果較好，但是工作量大，步驟繁瑣也使得蟲體的大量純化較難進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱及其制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱的制備方法，包括以下步驟：

（1）抗體的純化：

利用protein?G層析柱純化血清抗體：將填料與結(jié)合緩沖液按照1:1體積比例預(yù)混后緩慢裝入層析柱中，待填料充分沉淀后按照流速1?ml/min加5?ml結(jié)合緩沖液來平衡，將染蟲綿羊血清按照流速1?ml/min加入到制好的層析柱中，收集流出液；用30?ml結(jié)合緩沖液按照流速2?ml/min過柱，待完全清洗后，用10-15?ml洗脫緩沖液按照流速1?ml/min過柱，收集流出液，SDS-PAGE驗(yàn)證純化效果；用平衡緩沖液平衡柱子，以備下次使用；

所述結(jié)合緩沖液：20?mmol/L磷酸氫二鈉，0.15?mol/L?氯化鈉，pH?8.0；

所述洗脫緩沖液A：0.1?mol/L?甘氨酸，pH?2.5；

所述平衡緩沖液：?1?mol/L?Tris-HCl，pH?8.5；

（2）抗體的上樣前處理：

用20?ml偶聯(lián)緩沖液清洗脫鹽柱，加入3?ml純化的IgG過柱脫鹽，收集流出液，將1/10流出液質(zhì)量的氧化劑偏高碘酸鈉固體粉末加入到樣品中進(jìn)行氧化處理，室溫振蕩1?h，立即再次進(jìn)行脫鹽處理；所述脫鹽柱：聚丙酰胺凝膠介質(zhì)；

（3）抗體的偶聯(lián)：

吸取2?ml?Affi-Gel凝膠至15?ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10?ml偶聯(lián)緩沖液，混合均勻，待凝膠完全沉淀后，移除上清液，重復(fù)上述清洗過程；清洗完成后，再次加入5?ml偶聯(lián)緩沖液，將其轉(zhuǎn)移至偶聯(lián)柱中；加抗體至偶聯(lián)柱中，室溫振蕩偶聯(lián)24?h，收集流出液檢測(cè)偶聯(lián)率；用1倍柱容量的PBS清洗偶聯(lián)柱，將偶聯(lián)完成的偶聯(lián)柱放入4℃保存?zhèn)溆茫凰雠悸?lián)緩沖液：100?mmol/L?醋酸鈉、100?mmol/L?氯化鈉，pH?5.5。

應(yīng)用本發(fā)明的免疫親和層析柱，從鏡檢圖中看出，視野中分散著純化后的羊泰勒蟲裂殖子，無其他雜質(zhì)存在，且細(xì)胞形態(tài)完整獨(dú)立，因此本發(fā)明對(duì)于羊泰勒蟲裂殖子的純化有較好的效果。

附圖說明

圖1：利用protein?G?提純IgG后的SDS-PAGE電泳圖；

圖2：蟲體純化后1000倍油鏡鏡檢圖；

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

免疫親和層析柱的制備方法：

（1）抗體的純化：

利用protein?G層析柱（購自南京金斯瑞生物科技有限公司）純化血清抗體。