[發明專利]表達人血清白蛋白的質粒和重組菌以及它們的應用

有效

• 申請號: 201310078280.3
• 申請日: 2013-03-12
• 公開（公告）號: CN103194481A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 徐存拴;史世領;史世會;張全義;常翠芳;趙茜怡
• 申請（專利權）人: 河南新鄉華星藥廠
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種表達人血清白蛋白的質粒和重組菌以及它們的應用。

背景技術

天然人血清白蛋白(human?serum?albumin，HSA)在肝臟中由肝實質細胞合成，在血漿中的半壽期約為15-19天，是非糖蛋白，等電點(PI)為4.7。人血清白蛋白是由585個氨基酸組成的單鏈蛋白質，分子量為66.5kDa，為由α-螺旋組成的心形分子，包含三個結構域(1-195AA的結構域I、196-383A的結構域Ⅱ、384-585A的結構域Ⅲ)。

通過比對不同來源的白蛋白氨基酸序列發現，白蛋白中Gys位置十分保守，這就決定了它的三維結構的保守性。此外，白蛋白分子會因結合的分子大小不同，環境條件不同而使形狀有所變化。在非變性條件下，白蛋白分子內部的二硫鍵又會使其恢復原狀，所以白蛋白具有良好的彈性。

人血清白蛋白是血液系統的重要組成部分，其獨特的三級空間結構，使其擁有了結合、運輸內源性和外源性物質，維持血液膠體滲透壓，清除自由基，抑制血小板功能，抗凝血及影響血管滲透性等多樣的生化特性，成為現代醫學中十分重要的生物制品。據統計，在美國有38%的白蛋白被用作治療急性血容量減少以及其他原因造成的血容量減少等。另外，人血清白蛋白還可以抑制多核細胞產生自由基，對自由基進行清除，維持體系統的正常秩序。它還是許多內源性和外援性物質的重要載體，臨床上廣泛應用于高膽紅素血癥(新生兒)、白細胞增多癥、人血清白蛋白過少癥、以及呼吸窘迫綜合征等多種疾病的治療。因此，人血清白蛋白也逐漸成為了臨床用量最大的蛋白制劑。

血漿來源的人血清白蛋白給人類帶了各種疾病傳播的危險，尤其是HIV、HBV病毒，為疾病的治療帶來了不安全的因素。而從生物工程和基因重組技術為基點出發得到的人血清白蛋白就在根源上避免了病毒的污染，成為了近年來越來越多的科研工作者的研究目標。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于表達人血清白蛋白的質粒及其應用。

本發明提供的用于表達人血清白蛋白的質粒，包括表達盒甲和表達盒乙；

所述表達盒甲自上游至下游依次包括：序列表的序列3所示的AOX1啟動子、人血清白蛋白的編碼基因、序列表的序列4所示的CYC1翻譯終止子；

所述表達盒乙自上游至下游依次包括：序列表的序列5所示的GAP啟動子、所述人血清白蛋白的編碼基因、序列表的序列6所示的AOX1翻譯終止子；

所述人血清白蛋白為如下（1）或（2）：

（1）由序列表中序列11所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

（2）將序列11的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列11衍生的蛋白質。

所述人血清白蛋白的編碼基因為如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：

1）編碼區如序列表中序列2自5’末端第13至1842位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2所示的DNA分子；

4）在嚴格條件下與1）或2）或3）限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；

5）與1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。

所述嚴格條件為在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

所述用于表達人血清白蛋白的質粒還包括可DNA片段丙；所述DNA片段丙包括序列表的序列7所示的ADE2啟動子和序列表的序列8所示的ADE2基因，且由所述ADE2啟動子啟動所述ADE2基因的表達。

所述DNA片段丙中還可包括序列表的序列9所示的TRP2基因、序列表的序列10所示的氨芐青霉素抗性基因和pUC復制起點。

所述重組質粒的制備方法具體如下：將用限制性內切酶BglII和BamHI雙酶切重組質粒pGAGZαA-HSA得到含有所述表達盒乙的片段（約2.8kb的片段）插入重組質粒pPink-HC-HSA的BamHI酶切位點，得到所述重組質粒（重組質粒pPGH-HX02）；

所述重組質粒pPink-HC-HSA為在pPink-HC載體的EcoRI和KpnI酶切位點之間插入序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質粒；