[發明專利]一種用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌的方法

有效

• 申請號: 201310076887.8
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103173365A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 馬志強;畢秋艷;張小風;王文橋;韓秀英
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一種用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌的方法。

背景技術

目前葡萄霜霉病（Grape?downy?mildew）是葡萄種植中最重要的病害，在我國各葡萄產區均有分布，多發生在雨水較多的地區和年份，在5-6月份開始發生，7-9月為發病盛期。主要危害葉片，也能侵染嫩梢、花序、幼果等幼嫩組織。病害流行年份，病葉焦枯早落，病梢扭曲，發育不良，對樹勢和產量影響嚴重。截止2010年，全國葡萄栽培面積達到了552,000hm²，重病區的發病率在70%以上。

葡萄霜霉菌是專性寄生真菌，葉片發病部位產生白色霜狀霉層，即病菌的孢子囊及孢子囊梗。自氣孔伸出的孢子囊梗上生孢子囊，孢子囊呈卵形或橢圓形，頂端有乳頭狀突起，在水中萌發時產生游動孢子。游動孢子呈腎形，在扁平的一側生有兩根鞭毛，能在水中游動，在水中游動變成圓形靜止孢子，并同時長出芽管，經氣孔侵入寄主。

自然環境中，游動孢子通過雨水濺到葡萄幼嫩組織上，通過氣孔侵入組織細胞進行初侵染。經過一定的潛育期，形成初次病斑-組織上的油狀斑點，在初次病斑上形成孢子囊梗和孢子囊，孢子囊萌發產生的游動孢子又通過雨露進行再侵染。在整個生長季過程中，只要條件適宜，病菌就會不斷進行重復侵染，使病害流行。

葡萄霜霉病菌是專性寄生菌，在培養基上不能分離培養且在室內不能夠大量繁殖，這嚴重限制了葡萄霜霉病菌室內監測抗藥性、新藥劑的篩選、新藥劑抗藥性風險評估及致病性分化等研究工作的開展。研究人員不得不只能在短時間內不斷地去田間采集該病菌用于試驗的需求，這樣不但增加了工作量，試驗成本也大大提高。因此，迫切需要發明一種簡單易行的方法用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌，保證葡萄霜霉病菌的研究工作順利展開。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌的方法，該方法可在室內大量培養繁殖葡萄霜霉病菌，且簡單、易行。

本發明的技術方案是利用葡萄霜霉病菌的侵染循環原理建立的該病菌的培養繁殖方法。具體的，該方法包括如下步驟：

（1）采集葡萄霜霉病菌菌樣：在不同地區的葡萄種植區采集葡萄霜霉病菌的病葉，低溫0℃-10℃保存帶回室內；

（2）孢子囊懸浮液的制備：（A1）將病葉表面雜質和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，在18℃-20℃下黑暗培養24h-32h誘導產生新生的孢子囊；

（A2）將新生孢子囊沖下制成孢子囊含量為1×10⁵個-1.5×10⁵個/mL的孢子囊懸浮液；

（A3）將新生孢子囊懸浮液于4℃預冷20min-30min，室溫放置待懸浮液溫度為室溫時用于接種；

（3）葡萄品種及葉片的選擇：葡萄品種采用易感霜霉病品種；葉片選擇所述易感品種植株葉齡一致、枝條頂端第一至第三片完全展開的健康葉片；同時，所述葡萄植株及葉片生長期均未用過藥且無霜霉病發生；

（4）孢子囊懸浮液的接種：將孢子囊懸浮液用噴霧法離體接種（3）中所述健康葡萄葉片；

（5）葉片保濕培養：（A1）在培養皿中鋪有兩層無菌水浸濕的濾紙上放置玻璃棒，待葉片接種后立即將接種后的葉片正面朝下放在玻璃棒上，葉片不與濾紙直接接觸，葉柄用脫脂棉保濕，將培養皿密封；

（A2）將上述裝有葉片的培養皿置于18℃-20℃下黑暗、RH100%條件下培養24h-32h后進行光照培養12h，再進行黑暗培養12h，按此順序以后每天18℃-20℃下進行12小時光照/黑暗交替培養至霜霉病菌侵染葉片發病產生大量孢子囊，此期間保證足夠濕度RH100%。

優選地，本發明的用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌的方法還包括如下步驟：

（6）菌種純化：待葡萄霜霉病菌侵染葉片開始形成病斑后，剪取某一病斑（病斑面積大小一定）進行單獨培養，沖洗單一病斑孢子囊成孢子囊懸浮液，過濾離心，將孢子囊懸浮液稀釋成孢子囊含量為1×10⁵個-1.5×10⁵個/mL的孢子囊懸浮液，4℃低溫誘導20min-30min，室溫下放置一定時間，待孢子囊懸浮液溫度為室溫時，分散噴于葡萄葉片，逐天進行觀察葉片發病情況，待霜霉病斑發生初期，繼續對單一病斑進行剪切獨立培養，連續重復兩次，得到相對比較純的菌系，同樣方法繼續擴繁2代獲得大量的孢子囊含量為1×10⁵個-1.5×10⁵個/mL葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液；