[發明專利]一種用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌的方法

有效

• 申請號: 201310076887.8
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103173365A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 馬志強;畢秋艷;張小風;王文橋;韓秀英
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）采集葡萄霜霉病菌菌樣：在不同地區的葡萄種植區采集葡萄霜霉病菌的病葉，低溫0℃-10℃保存帶回室內；

（2）孢子囊懸浮液的制備：（A1）將病葉表面雜質和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，在18℃-20℃下黑暗培養24h-32h誘導產生新生的孢子囊；

（A2）將新生孢子囊沖下制成孢子囊含量為1×10⁵個-1.5×10⁵個/mL的孢子囊懸浮液；

（A3）將新生孢子囊懸浮液于4℃預冷20min-30min，室溫放置待懸浮液溫度為室溫時用于接種；

（3）葡萄品種及葉片的選擇：葡萄品種采用易感霜霉病品種；葉片選擇所述易感品種植株葉齡一致、枝條頂端第一至第三片完全展開的健康葉片；同時，所述葡萄植株及葉片生長期均未用過藥且無霜霉病發生；

（4）孢子囊懸浮液的接種：將孢子囊懸浮液用噴霧法離體接種（3）中所述健康葡萄葉片；

（5）葉片保濕培養：（A1）在培養皿中鋪有兩層無菌水浸濕的濾紙上放置玻璃棒，待葉片接種后立即將接種后的葉片正面朝下放在玻璃棒上，葉片不與濾紙直接接觸，葉柄用脫脂棉保濕，將培養皿密封；

（A2）將上述裝有葉片的培養皿置于18℃-20℃下黑暗、RH100%條件下培養24h-32h后進行光照培養12h，再進行黑暗培養12h，按此順序以后每天18℃-20℃下進行12小時光照/黑暗交替培養至霜霉病菌侵染葉片發病產生大量孢子囊，此期間保證濕度RH100%。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，本發明的用于室內培養繁殖葡萄霜霉病菌的方法還包括如下步驟：

（6）菌種純化：待葡萄霜霉病菌侵染葉片形成病斑后，剪取某一病斑進行單獨培養，沖洗單一病斑孢子囊成孢子囊懸浮液，過濾離心，將孢子囊懸浮液稀釋成孢子囊含量為1×10⁵個-1.5×10⁵個/mL的孢子囊懸浮液，4℃低溫誘導20min-30min，待孢子囊懸浮液溫度為室溫時，分散噴于葡萄葉片，待霜霉病斑發生初期，繼續對單一病斑進行剪切獨立培養，連續重復兩次，得到相對比較純的菌系，同樣方法繼續擴繁2代獲得孢子囊含量為1×10⁵個-1.5×10⁵個/mL的孢子囊懸浮液；

（7）將（6）中純化后的孢子囊懸浮液按步驟（4）進行接種，并按步驟（5）進行葉片保濕培養至霜霉病菌侵染葉片發病產生大量孢子囊。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述葡萄霜霉病菌菌樣的采集是在我國不同省份的不同葡萄種植區采用5點法取樣，每點取10個葡萄霜霉病菌的病葉，用保溫箱低溫0-10℃保存帶回室內。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（2）中（A1）中在壓力0.08Mpa下用無菌水將病葉表面雜質和霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，將病葉置于放有濕潤濾紙的培養皿中，用保鮮膜將培養皿封口，在18℃下黑暗保濕培養24h誘導產生新生的孢子囊。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（2）中（A1）中用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機帶動喉頭噴霧器將病葉表面雜質和霜霉病菌表面老熟的孢子囊用無菌水沖洗掉。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（2）中（A2）中在壓力0.08Mpa下用無菌水將新生孢子囊洗下來，4號定性濾紙過濾，以2000r/min離心5min，重復離心2次，配制成孢子囊含量為1×10⁵個-1.5×10⁵個/mL的孢子囊懸浮液。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2）中（A2）中用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機帶動喉頭噴霧器用無菌水將新生孢子囊洗下來。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（3）中所述易感霜霉病品種為歐亞種群赤霞珠、歐美雜交種巨峰或歐美雜交種高妻。

9.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（4）中所述孢子囊懸浮液的接種方法為:用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機帶動喉頭噴霧器將孢子囊懸浮液均勻噴霧于葉片背面，液滴在葉片剛好不滑落為宜。

10.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（5）中（A2）中將上述裝有葉片的培養皿置于18℃下黑暗、RH100%條件下培養24h后進行光照培養12h，再進行黑暗培養12h，按此順序以后每天18℃下進行12小時光照/黑暗交替培養至霜霉病菌侵染葉片發病產生大量孢子囊，此期間保證濕度RH100%。