[發(fā)明專利]原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA的分析方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310076687.2
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN104046679A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發(fā)明（設計）人: 戴勇;譚奎璧
• 申請（專利權(quán)）人: 戴勇;譚奎璧
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/00
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 何平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腎病研究領(lǐng)域，尤其是涉及一種原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA的分析方法和應用。

背景技術(shù)

原發(fā)性IgA腎病（IgA?nephropathy，IgAN）是以IgA為主的免疫球蛋白彌漫沉積在腎小球系膜區(qū)以及毛細血管袢，臨床表現(xiàn)和病理改變各異的臨床病理綜合征。IgAN是世界上最常見的原發(fā)性腎小球疾病，亞洲多發(fā)，約占我國原發(fā)性腎小球腎炎30%～40%，也是導致終末期腎臟病的主要病因之一。迄今為止發(fā)病機制不明，具有種族地域差異性、臨床表現(xiàn)多樣、治療缺乏靶向性、預后亦相差懸殊，給早期診斷和治療造成了很大的困難。雖然目前IgAN的發(fā)病機制尚不清楚，但普遍認為常由多個微效基因的累加和某些環(huán)境因子的共同作用而致病，與遺傳因素息息相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，有必要提供一種從遺傳角度出發(fā)可應用與研究IgAN發(fā)病機制的原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA的分析方法和應用。

一種原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA的分析方法，包括如下步驟：

采集原發(fā)性IgA腎病患者和正常組的腎臟組織的細胞總RNA，用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化出18～30nt長度的小RNA分子，將分離出的小RNA分子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄處理后形成cDNA片段，再對形成的cDNA片段的兩端加上接頭序列，經(jīng)RT-PCR擴增后形成RNA文庫；

對構(gòu)建的所述RNA文庫進行測序，然后對測序所得的序列進行去接頭、去污染處理得到干凈的小RNA分子序列并對所得的序列進行長度分布分析，去除重復序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA，將剩余的序列與miRNA數(shù)據(jù)庫中人miRNA序列進行比對分析，獲得原發(fā)性IgA腎病患者和正常組的已知miRNA的表達量信息；

將原發(fā)性IgA腎病患者和正常組中表達的已知miRNA的表達量歸一化到同一量級，歸一化公式為：歸一化表達量=miRNA表達量/樣品總表達量*10⁶，使用Audic?and?Claverie?test的統(tǒng)計方法比較原發(fā)性IgA腎病患者和正常組的miRNA表達差異，得到所述原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA。

在其中一個實施例中，所述對構(gòu)建的所述RNA文庫進行測序是使用Illumina?HiSeq^TM2000測序儀對構(gòu)建的所述RNA文庫進行深度測序。

在其中一個實施例中，所述去除重復序列、rRNA、tRNA、mRNA降解片段、scRNA、snoRNA、snRNA及piRNA是使用SOAP2.0軟件將得到的所述干凈的小RNA序列與repeatmarker、Genebank、Rfam、UCSC和piRNA數(shù)據(jù)庫中的RNA序列進行比對分類處理。

在其中一個實施例中，所述miRNA數(shù)據(jù)庫是miRBase18.0。

在其中一個實施例中，所述使用Audic?and?Claverie?test的統(tǒng)計方法比較原發(fā)性IgA腎病患者和正常組的miRNA表達差異過程中，選擇對歸一化處理后在任一組中表達量不小于10TPM的miRNA，若該miRNA在兩組之間的倍比值不小于2且P值小于0.001，則該miRNA在原發(fā)性IgA腎病患者和正常組中差異表達。

上述原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA的分析方法通過高通量測序技術(shù)對原發(fā)性IgA腎病患者和正常組的腎臟組織總RNA分析處理得到原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA，深入研究這些差異表達的miRNA將有助于進一步闡明原發(fā)性IgA腎病的發(fā)病機理，為原發(fā)性IgA腎病的診斷和治療提供新途徑。上述原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA的分析方法設計合理可行，能夠有效地協(xié)助建立一種原發(fā)性IgA腎病差異表達miRNA的圖譜模型，獲取作為中間結(jié)果的原發(fā)性IgA腎病的相關(guān)信息。

一種高通量測序平臺，所述測序平臺上固定有上述原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA的分析方法得到的所述原發(fā)性IgA腎病腎臟組織差異表達miRNA。

通過上述高通量測序，可以為初步診斷原發(fā)性IgA腎病提供中間結(jié)果信息，檢測過程方便，不需要使用傳統(tǒng)的繁雜的檢測步驟，但由于原發(fā)性IgA腎病往往是一種綜合病征，獲取這些中間結(jié)果之后還需要結(jié)合其他檢測數(shù)據(jù)才能診斷為是否是原發(fā)性IgA腎病。

附圖說明