[發明專利]一種甲基化DNA檢測方法無效

申請號：	201310076396.3	申請日：	2013-03-11
公開（公告）號：	CN104046678A	公開（公告）日：	2014-09-17
發明（設計）人：	孫喜元	申請（專利權）人：	蘇州承美生物科技有限公司
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68
代理公司：	蘇州華博知識產權代理有限公司 32232	代理人：	黃珩
地址：	215200 江蘇省***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種甲基化 dna 檢測方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體涉及一種甲基化DNA的檢測方法。

背景技術

DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點的胞嘧啶（C）殘基的5'碳上被修飾了一個甲基。DNA甲基化是最早發現的DNA修飾之一，是表觀遺傳學的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發生在DNA鏈上的CG二核苷酸的胞嘧啶殘基上，這常見于基因5’端表達調控序列。DNA甲基化在基因表達的調控中具有重要作用，參與了動物胚胎發育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及蛋白質互相作用方式的改變，從而控制基因表達。

DNA甲基化狀態的改變是引起腫瘤的一個重要因素。?CpG島局部甲基化水平的異常升高,可以導致基因組的不穩定和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發生癌癥的機率就會提高，所以DNA甲基化在腫瘤早期檢測中的應用十分引人注目。研究表明，表觀遺傳的變化伴隨腫瘤的發生與發展，因而檢測DNA甲基化改變可以有助于腫瘤的早期發現。???????目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因，這是因為人們發現腫瘤的發生可能與抑癌基因啟動子區的CpG島甲基化造成抑癌基因關閉有關。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測可以用于腫瘤發生的早期預測。

????CpG島甲基化的檢測方法眾多,其原理分別基于甲基化敏感的限制性內切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測法。甲基化敏感性限制性內切酶/Southern法（methylation-sensitive?restriction?Endonuclease/Southern,?MSRE-?Southern）是比較傳統的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法（Methylation?Specific?PCR,?MSP）及其衍生的甲基化DNA檢測方法，是目前檢測DNA甲基化的常用方法，其靈敏度較高，但容易受干擾，特異性差，從而導致檢測的假陽性率也很高。

發明內容

本發明提供一種甲基化DNA檢測方法，能夠有效地排除非甲基化DNA的影響，很好地解決了現有技術檢測特異性低、容易被干擾、假陽性高等缺點。

為達到上述目的，本發明的技術方案是，一種甲基化DNA檢測方法，所述甲基DNA檢測方法包括如下步驟：

步驟1，提取待測樣品DNA；

步驟2，確定待測基因的檢測區域，在檢測區域選擇一段序列，以這一段序列的互補序列作為檢測探針的序列，使這一段序列長18-120堿基；對所設計并合成的探針的5’端進行標記；

步驟3，用標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA作為檢測的陽性標準對照和陰性標準對照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測探針與待測樣品DNA、梯度稀釋的標準DNA樣品分別進行雜交反應；

步驟4，將步驟3的反應物分別加入反應載體中，捕捉經過進行雜交反應的被標記的探針，并洗滌；

步驟5，加入單克隆抗體，進行反應并洗滌；

步驟6，加入偶聯單克隆抗體，進行反應并洗滌；

步驟7，加入HRP檢測試劑進行反應；

步驟8，終止反應并用酶標儀進行測定，計算甲基化DNA的濃度和量。

優選的，所述步驟2中對探針進行標記是用生物素或具有抗原性質的物質進行標記。