[發(fā)明專利]一種甲基化DNA檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310076396.3
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN104046678A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫喜元
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州承美生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州華博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32232
• 代理人: 黃珩

1.一種甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述甲基化DNA檢測方法包括以下步驟：

步驟1，提取待測樣品DNA；

步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，在檢測區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補(bǔ)序列作為檢測探針的序列，使這一段序列長18-120堿基；對所設(shè)計并合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記；

步驟3，用標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA作為檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)對照和陰性標(biāo)準(zhǔn)對照，作梯度稀釋；用所述的檢測探針與待測樣品DNA、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)；

步驟4，將步驟3的反應(yīng)物分別加入反應(yīng)載體中，捕捉經(jīng)過進(jìn)行雜交反應(yīng)的被標(biāo)記的探針，并洗滌；

步驟5，加入單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；

步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；

步驟7，加入HRP檢測試劑進(jìn)行反應(yīng)；

步驟8，終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，計算甲基化DNA的濃度和量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟2中對探針進(jìn)行標(biāo)記是用生物素或具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟3的雜交反應(yīng)是在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60℃的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟3中標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA，是經(jīng)確定的純的人類甲基化DNA和非甲基化DNA。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟5中的單克隆抗體是小鼠抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體，所述步驟5的反應(yīng)是在1xPBST的鹽濃度、pH8.0、0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25℃的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟6中的偶聯(lián)單克隆抗體是HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體，所述步驟6的反應(yīng)是在1xPBST的鹽濃度、pH8.0、0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25℃的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟7的HRP檢測試劑是HRP底物：TMB，3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述待測樣品為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、直腸細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。