[發明專利]一種調控干細胞體外三維定向分化的方法

在審

• 申請號: 201310076323.4
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN104046587A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 馬小軍;劉洋;王淑君;孫廣煒
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/077;C12N5/079;C12N11/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及再生醫學領域，是一種調控干細胞體外三維定向分化的方法。

背景技術

干細胞由于具有自我更新和分化的能力，是損傷組織修復的理想種子細胞。但是當干細胞植入體內受損部位后，干細胞除了分化為所需要的組織細胞，參與組織修復，同時也分化為其它類型的細胞，甚至具有較高的致瘤性。對干細胞進行體外預分化，使之在移植之前預先分化為成熟的組織細胞或前體細胞，能夠提高定向分化效率，減低干細胞在體內向其它類型細胞分化的能力，從而提高組織修復效果，并降低致瘤風險。

在體內細胞生長在細胞外基質所構成的三維網絡中，研究表明體外二維培養條件下的細胞逐漸丟失了其表型和功能，而體外三維培養有利于細胞的功能維持，能夠模擬體內特異組織細胞微環境，更好地促進干細胞體外的定向分化。目前，調控干細胞體外定向分化的三維體系，采用了脫細胞支架、膠原支架、或聚乳酸支架等，這些支架有的具有較高免疫原性，有的缺乏促分化的特殊細胞外基質成分，有的降解產物不利于細胞培養以及組織修復，這導致了干細胞體外定向分化效率低，獲得細胞不具有體內正常生理功能等問題。

由于現有誘導分化體系存在上述缺陷，嚴重限制了干細胞體外定向分化技術的進一步發展與臨床應用，因此急需研發便捷實用的誘導干細胞三維分化的新方法，即通過利用三維培養以及添加基質成分來構建能夠模擬體內組織的微環境，以實現體外對干細胞定向預分化的調控，進一步促進干細胞在再生醫學領域的應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種調控干細胞體外三維定向分化的方法，即利用含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠實現對干細胞體外定向分化的調控。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

本發明將干細胞包埋在含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠中，添加誘導分化培養液，通過改變制備微膠珠時海藻酸鈉和硫酸軟骨素的質量比調控干細胞體外定向分化，并且在分化結束后，可利用檸檬酸鈉溶液溶解海藻酸鈣微膠珠，進而得到純凈的分化細胞。

所述干細胞包括胚胎干細胞、iPS細胞、間充質干細胞、神經干細胞、虹膜色素上皮細胞、羊膜上皮細胞、或造血干細胞。

所述含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠為由含海藻酸鈉和硫酸軟骨素的溶液經過鈣液鈣化所制備，此溶液溶劑為生理鹽水，海藻酸鈉濃度為0.3-4%(W/V)，硫酸軟骨素溶液濃度為0.5-10%(W/V)，海藻酸鈉和硫酸軟骨素的質量比為1-20；

含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠直徑為200-2000μm；

海藻酸鈉的分子量為100-1000kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例（GM比）范圍為0.2-3，且海藻酸鈉為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸（IKVAV）修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸（YIGSR）修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉；

硫酸軟骨素平均分子量為2-40kDa；

所述定向分化包括干細胞向神經、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨或脂肪細胞定向分化。

所述定向分化所使用的培養容器為靜態培養體系或生物反應器；

靜態培養體系指使用培養瓶、培養板、培養皿、或培養袋培養；

生物反應器包括旋轉式反應器、灌注式反應器、攪拌式反應器、或氣升式反應器。

本發明具有如下優點：

1．操作簡單，成本低。本發明利用含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠對干細胞體外定向分化進行調控，方法簡單，避免使用昂貴材料和工藝；

2．模擬體內特異組織分化微環境，提高干細胞分化效率和功能。三維海藻酸鈣微膠珠為干細胞提供了三維生長環境，并且硫酸軟骨素的添加進一步模擬了體內組織的細胞外基質成分，因此本發明能夠在近似于體內特異組織微環境的條件下誘導干細胞分化，其誘導效率和細胞功能進一步提高；

4．高活性收集分化細胞。在分化結束后，利用檸檬酸鈉溶液溶解微膠珠，通過離心可在生理條件下收集分化的細胞，細胞活性高，功能不受影響；

5．應用范圍廣。本發明方法可促進干細胞向神經、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨或脂肪細胞定向分化，并可放大培養規模，具有臨床應用前景。

附圖說明

圖1為本發明的示意圖：培養容器1，含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠2，干細胞3；

圖2為含有20%(W/V)硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠中細胞的軟骨特異性染色；