[發(fā)明專利]攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201310076298.X | 申請(qǐng)日： | 2013-03-11 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN103215234A | 公開（公告）日： | 2013-07-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 夏海濱;張偉鋒;劉思也 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 陜西師范大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N7/01 | 分類號(hào)： | C12N7/01;C12N15/861;A61K48/00;A61P7/04;A61P43/00 |
| 代理公司： | 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201 | 代理人： | 申忠才 |
| 地址： | 710062 *** | 國(guó)省代碼： | 陜西;61 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 攜帶 核酸酶 表達(dá) 元件 供體 dna 病毒 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于：缺失E1和E3區(qū)，在缺失區(qū)插入了鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于：在缺失的E1區(qū)插入供體DNA、在缺失的E3區(qū)插入鋅指核酸酶表達(dá)元件，或在缺失的E1區(qū)插入鋅指核酸酶表達(dá)元件、在缺失的E3區(qū)插入供體DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于：所述的鋅指核酸酶表達(dá)元件是由真核啟動(dòng)子與其下游的鋅指核酸酶基因和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于：所述的真核啟動(dòng)子是Tet-on誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，該Tet-on誘導(dǎo)性啟動(dòng)子由以下結(jié)構(gòu)組成：7個(gè)重復(fù)的四環(huán)素反應(yīng)元件，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動(dòng)子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tightminiCMV，在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S-M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA，在右側(cè)tight?miniCMV的下游插入一對(duì)鋅指核酸酶基因，在鋅指核酸酶基因的3＇端連接有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；所述的兩個(gè)鋅指核酸酶基因間通過自剪切多肽相連；所說的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)是SV40pA、TKpA中的一種；
miniCMV的序列如下：
GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC
tight?miniCMV的序列如下：
GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于：所述的供體DNA是靶向該腺病毒所攜帶的鋅指核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)，它由上、下游同源臂組成，上、下游同源臂分別是由距離該腺病毒載體攜帶的鋅指核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)1bp到5000bp堿基數(shù)的DNA序列組成，每條同源臂的長(zhǎng)度為50bp到3000bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于：所述的供體DNA在上、下游同源臂之間插入了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、報(bào)告基因表達(dá)元件、篩選基因表達(dá)元件、功能基因表達(dá)元件中的任意一種。
7.一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于由以下步驟組成：
（1）構(gòu)建腺病毒骨架載體
以商業(yè)化的pAdEasy-1載體為基礎(chǔ)進(jìn)行改造。構(gòu)建腺病毒E3區(qū)穿梭載體，在E3區(qū)穿梭載體中插入lacZα篩選基因和SwaⅠ酶切位點(diǎn)，通過同源重組和藍(lán)白斑篩選將SwaⅠ酶切位點(diǎn)引入到腺病毒缺失的E3區(qū)，獲得可以在缺失的E3區(qū)插入外源基因的腺病毒骨架載體；
（2）構(gòu)建攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體
將真核啟動(dòng)子、鋅指核酸酶基因、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)依次插入到腺病毒E3區(qū)穿梭載體中；
（3)構(gòu)建攜帶供體DNA的腺病毒E1區(qū)穿梭載體
將供體DNA的上、下游同源臂依次插入到腺病毒E1區(qū)穿梭載體，在上、下游同源臂之間插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、篩選基因表達(dá)元件、功能基因表達(dá)元件中的任意一種；
（4）將攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體與SwaⅠ線性化的腺病毒骨架載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體，將攜帶供體DNA的腺病毒E1區(qū)穿梭載體與攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體；
（5）將構(gòu)建好的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體通過磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增、純化獲得純化的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒。
8.攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒在制備治療遺傳性疾病藥物中的用途。
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