[發明專利]攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201310076298.X
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103215234A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 夏海濱;張偉鋒;劉思也
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;A61K48/00;A61P7/04;A61P43/00
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒及其構建方法和應用。

技術背景

基因組的靶向修飾包括對基因組內源性基因序列的改造或者在基因組的特定位置插入外源性基因片段。這項技術為研究特定基因功能提供了有力工具，此外研究人員可以利用該技術建立特定的動物模型來進行基因功能研究或新藥物的研發。傳統的基因靶向修飾技術是依賴于自然狀態下的同源重組（Homologous?recombination，HR），效率非常低，大約為10^-6，因而大大限制了該技術的應用。鋅指核酸酶(Zinc?finger?nuclease,ZFN)技術的出現給基因組靶向修飾帶來了希望。

ZFN技術是近年來發展起來的一項新的技術，通過人工設計的ZFN在基因組DNA的特定位置切割產生雙鏈斷裂（DSB），繼而通過細胞內源性的修復機制對斷裂部位的基因進行修飾。同自然狀態下的同源重組技術相比較，ZFN技術可以使基因組靶向修飾的效率提高了10³～10⁵倍。ZFN介導的基因定點修飾已經在多種體外培養的細胞中獲得成功，包括人的胚胎干細胞(embryonic?stem?cell,ES)和誘導性多能干細胞(induced?pluripotent?stem?cells,iPS)、植物、果蠅、爪蟾、線蟲、斑馬魚、小鼠、大鼠等的細胞，顯示出該技術的廣泛適用性，這將有力地推動基因靶向修飾技術的應用研究。

由于ZFN介導的基因靶向修飾技術需要將ZFN表達元件和供體DNA同時導入到細胞中，因此將ZFN表達元件和供體DNA導入靶細胞的效率成為影響ZFN介導的基因靶向修飾的效率的重要因素。在體外實驗中通常采用核轉染的方法，這種方法轉染效率較高，然而該方法只局限于部分細胞，對有些細胞的轉染效率仍然是很低的，且該方法無法在體內實驗中使用。腺病毒載體由于其諸多特點，如：宿主范圍廣、病毒滴度高、載體容量大等，成為將ZFN表達元件和供體DNA同時導入到靶細胞中的一種理想的工具。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題在于克服上述現有技術的缺點，提供一種攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒。

本發明所要解決的另一個技術問題在于提供一種攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒的構建方法。

本發明所要解決的還有一個技術問題在于為攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒提供一種新用途。

解決上述技術問題所采用的技術方案是：缺失E1和E3區，在缺失區插入了鋅指核酸酶表達元件和供體DNA。

本發明在缺失的E1區插入供體DNA、在缺失的E3區插入鋅指核酸酶表達元件，或在缺失的E1區插入鋅指核酸酶表達元件、在缺失的E3區插入供體DNA。

本發明的鋅指核酸酶表達元件是由真核啟動子與其下游的鋅指核酸酶基因和轉錄終止信號組成。

本發明的真核啟動子是Tet-on誘導性啟動子，該Tet-on誘導性啟動子由以下結構組成：7個重復的四環素反應元件，在該重復序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側的miniCMV和右側的tight?miniCMV，在左側miniCMV的下游連接有rtTA2S-M2轉錄因子和SV40pA，在右側tightminiCMV的下游插入一對鋅指核酸酶基因，在鋅指核酸酶基因的3＇端連接有轉錄終止信號；所述的兩個鋅指核酸酶基因間通過自剪切多肽相連；所說的轉錄終止信號是SV40pA、TKpA中的一種；

miniCMV的序列如下：

GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC

tight?miniCMV的序列如下：

GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。

本發明的供體DNA是靶向該腺病毒所攜帶的鋅指核酸酶的識別位點，它由上、下游同源臂組成，上、下游同源臂分別是由距離該腺病毒載體攜帶的鋅指核酸酶的識別位點1bp到5000bp堿基數的DNA序列組成，每條同源臂的長度為50bp到3000bp。