[發(fā)明專利]馬尾松和濕地松快速分子檢測方法及其特異性引物對

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310076041.4
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103173546A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賈婕;馮源恒;楊章旗;黃永利;黃雪芬
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及馬尾松、濕地松及其雜交品種的鑒定，尤其是一種馬尾松和濕地松快速分子檢測方法及其特異性引物對。

背景技術(shù)

馬尾松(Pinus?massoniana?Lamb.)是我國分布最廣的針葉樹種，也是我國南方地區(qū)重要的用材、荒山造林和工業(yè)原料樹種，其木材和松脂是許多森林工業(yè)、林產(chǎn)工業(yè)和造紙工業(yè)的主要原料。馬尾松在我國亞熱帶地區(qū)（約占國土1/5）山地均有分布，林分總面積居全國針葉樹種首位，蓄積量僅次于云杉、冷杉和落葉松，居全國針葉樹種第四位。濕地松(Pinus?elliottii)是我國南方人工林大面積成功推廣的引種樹種之一，具有速生、適應(yīng)性強(qiáng)、材質(zhì)好、松脂產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。

種間雜交是獲得雜種優(yōu)勢的主要方法，是林木遺傳育種研究的重要內(nèi)容。開展馬尾松與濕地松種間雜交研究，如何獲得兼具雙親優(yōu)點(diǎn)的雜交子代對我國的松樹改良具有深遠(yuǎn)意義。盡管馬尾松與濕地松為同一亞屬，但其原產(chǎn)地與親緣關(guān)系均相距甚遠(yuǎn)，未見成功雜交的先例。松樹的花粉具有氣囊隨風(fēng)擴(kuò)散能力極強(qiáng)，很容易對松樹雜交授粉形成污染干擾。因此，雜交子代的鑒定是確定雜交是否成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

在分子遺傳學(xué)水平進(jìn)行雜種鑒定是目前最可靠的鑒定方法之一，然而，目前尚無馬尾松、濕地松及其雜交品種的分子生物學(xué)鑒定方法，影響馬尾松和濕地松種間雜交研究順利進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高的馬尾松和濕地松快速分子檢測方法及其特異性引物對，為開展馬尾松和濕地松種間雜交研究建立了有效的松屬種間分子鑒定技術(shù)體系，對將來濕馬雜交苗木的鑒定和交易具有十分重要的意義。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：馬尾松和濕地松快速分子檢測方法，包括以下步驟：

<1>DNA提取

采用改進(jìn)的CTAB裂解-硅珠吸附法提取樣品DNA；

<2>PCR擴(kuò)增

用步驟<1>的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

PCR反應(yīng)體系：共10μL，包括模板DNA1.2μL、10×Buffer1μL、2mM-dNTP0.2μL、25mu-MgCl₂1.1μL、r-Taq0.1μL、F-primer0.25μL、R-primer0.25μL、ddH₂O5.9μL；

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃4min；梯度降溫擴(kuò)增16循環(huán)，第一次94℃15s，60℃15s，72℃30s，此后每個循環(huán)退火溫度均比前一個循環(huán)低0.5℃；一般性擴(kuò)增15循環(huán)94℃15s，52℃15s，72℃30s；延伸72℃20min；最終保存4℃；

<3>凝膠電泳

將步驟<2>的PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后銀染檢測。

上述檢測方法中，F(xiàn)-primer是引物PJ164L：CGTCGGTGAATCAGCAGC；R-primer是引物PJ164R：GATAAGCGAGTGGGAAGTA。

馬尾松和濕地松快速分子檢測方法的特異性引物對，該引物對為PJ164L/R，具有以下序列：

引物PJ164L：CGTCGGTGAATCAGCAGC（見SEQ.ID.No.1）；

引物PJ164R：GATAAGCGAGTGGGAAGTA（見SEQ.ID.No.2）。