[發明專利]一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法

有效

• 申請號: 201310074890.6
• 申請日: 2013-03-08
• 公開（公告）號: CN103146773A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 劉雙平;石貴陽;張梁;丁重陽;何冬旭;李贏
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P13/22
• 分類號: C12P13/22;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 無錫華源專利事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 馮智文

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種通過基因工程技術和發酵的手段增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。

背景技術

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）是一種人體必需但自身無法合成的具有生理活性的芳香族氨基酸，也是一種重要的醫藥和食用化學品中間體，在醫藥行業主要用于生產抗腫瘤藥物和氨基酸輸液制劑，在食品行業主要用于合成二肽甜味劑阿斯巴甜，具有良好的應用前景。生產L-苯丙氨酸的方法主要有水解抽提法、化學合成法、酶法和發酵法四種，其中，微生物發酵法所利用原料廉價易得，又可在常溫常壓下進行，是目前國內外生產L-苯丙氨酸的主流方法。L-苯丙氨酸在大腸桿菌細胞內通過芳香族氨基酸合成代謝途徑合成：葡萄糖進入細胞后經過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑合成磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸-赤蘚糖，在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（AroG）的作用下進入莽草酸途徑，在莽草酸激酶（AroK）、莽草酸脫氫酶（YdiB）等酶類的作用下合成分支酸，之后經分支酸變位元酶和預苯酸脫水酶（PheA）等酶作用生成芳香族氨基酸前體物，再經過酪氨酸轉氨酶（TyrB）的作用合成L-苯丙氨酸。

從自然界中篩選出的具有產酸能力的微生物菌株一般氨基酸積累量有限；通過特別修飾選育出的突變株雖可提高L-苯丙氨酸的生產效率，但其盲目性大，工作量繁重，生產成本高，且突變株一般攜帶有營養缺陷，產量進一步提高受到限制。通過基因克隆手段解除代謝調控位點以促進目的產物合成已成功應用于檸檬酸、乳酸、琥珀酸等多種代謝產物的發酵生產，是L-苯丙氨酸工業化生產的必然趨勢，但是，L-苯丙氨酸的代謝調控受限于基因轉錄起始、轉錄過程、翻譯起始、翻譯過程、酶量、酶活等多水平、不同層次的反饋控制，且由于質粒載體的大小受到限制，很難通過過量表達連續的多個基因來解除所有的調控位點，此外，大腸桿菌在發酵過程中會積累副產物——乙酸，其可限制菌體的生長及目的產物的合成，降低產率。總之，可高產L-苯丙氨酸且發酵成本低廉的基因工程菌株目前尚未見報道，難以形成產業化。

發明內容

針對現有技術存在的上述缺陷，本發明的目的在于提供一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。本發明可明顯增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸產量高，有害副產物乙酸濃度低，發酵成本低廉，工藝簡單，適宜產業化生產。

本發明的技術方案如下：

一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是將可同時過量表達酪氨酸轉氨酶TyrB、甲基紫羅堿外轉運蛋白YddG、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG、分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脫氫酶YdiB的重組質粒轉化宿主大腸桿菌，并通過液體發酵生產L-苯丙氨酸。

其進一步的技術方案為：

所述重組質粒是將大腸桿菌來源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾以解除其所受代謝調控，并插入載體構建而成；

所述液體發酵條件控制如下：發酵培養基的起始葡萄糖濃度為3～15g/L，發酵過程中的葡萄糖濃度為1～4g/L；發酵溫度35～42℃，發酵pH值6.5～7.5，通氣量0.5～1.0vvm，溶氧量為初始氧濃度的10～35%，發酵時間48～72h。

所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因的天然啟動子被其它不受末端代謝產物反饋阻遏的強啟動子所替換，以增強其表達水平。

所述TyrB編碼基因編碼框的起始堿基序列被SEQ?ID?NO:1所示的堿基序列替換，以解除其與阻遏蛋白TyrR的結合能力。

所述AroG氨基酸序列中第146位的天門冬氨酸被替換成天門冬酰胺，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。

所述PheA的R-domain結構域被刪除，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。

所述強啟動子包括P_R和/或P_L啟動子

本發明的有益技術效果如下：