[發明專利]一種固相制備促胰液素的方法

有效

• 申請號: 201310073954.0
• 申請日: 2013-03-08
• 公開（公告）號: CN103214568A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 姚志軍;馬亞平;袁建成
• 申請（專利權）人: 深圳翰宇藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/645
• 分類號: C07K14/645;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科;孫偉

技術領域

本發明涉及一種固相制備多肽藥物的方法，特別涉及一種固相制備促胰液素的方法，屬于藥物化學領域。

背景技術

促胰液素(英文名Secretin)是由位于十二指腸和空腸上段粘膜中的S細胞分泌，由27個氨基酸組成的具有螺旋結構的堿性多肽，具有調節胰腺外分泌、抑制胃酸分泌和胃運動等多種生理功能，其肽序為H-His-Ser-

????????????????????????????????????????????????????1Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gl????????????????????8????????????????????????????????16n-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH₂，也簡寫為HSDGTFTSELSRLRDSA

??????????24RLQRLLQGLV-NH₂，其結構式如下：

現有技術secretin的逐步偶聯的合成，采用全液相合成(JACS，1967,6753，采用全液相合成的缺點在于合成范圍小，一般都集中在10個氨基酸以內的多肽合成，還有合成中需要對中間體進行提純，時間長，工作量大。采用該方法，secretin的逐步偶聯的合成總收率小于10%。

Helv.Chim.Acta1976,1112,Int.J.Peptide?Protein?Res,1977,63)，固相采用Boc-策略(Int.J.Peptide?Protein?Res,1977,63)合成secretin，固相Boc-策略中，反復地用酸來脫保護，這種處理帶來了以下問題：如在肽與樹脂的接頭處，當每次用50%TFA脫Boc基時，有約1.4%的肽從樹脂上脫落，合成的肽越大，這樣的丟失越嚴重;此外，酸催化會引起側鏈的一些副反應，Boc合成法尤其不適于合成含有色氨酸等對酸不穩定的肽類。

現有技術(JACS,1968,4711;Chem.Ber.1972,2508;Chem.Ber.1974,215)公開了一種片段偶聯法制備secretin，由于secretin結構中既有多個疏水性的Leu、Val，又有親水性的Lys、His和Arg等，使片斷的溶解性很差，進而在片斷合成以及各片斷偶聯的過程中需要大量溶劑，且由于反應液濃度較稀，使反應不夠完全。

另外，還有一種合成方法(US4755591)采用高氯酸保護的Arg，能改善片斷的溶解性，其先采用Z策略合成片斷，然后再脫除Z保護基后用高氯酸處理得到高氯酸保護Arg的片斷。由于上高氯酸前和上高氯酸后的片斷均需純化，故增加了合成和純化的工作量。

上述現有技術雖能用于secretin的合成，但是收率較低，其中，secretin的液相逐步偶聯的合成總收率小于10%；固相Boc-策略合成總收率小于20%；采用高氯酸保護Arg的合成策略其合成總收率小于30%。因此，為提高secretin的合成收率，降低生產成本，提高該品的產業化生產和廣泛應用，需進一步研究新的高收率合成方法。

發明內容

本發明采用固相Fmoc策略進行合成，為了解決合成中的溶解性問題和肽鏈在合成中的折疊問題，使用假脯氨酸代替肽鏈中的部分絲氨酸進行合成，有效地提高了促胰液素的收率和純度，更易于產業化。

本發明所述一種固相制備促胰液素的方法，包括以下步驟：

1)選擇合適的固相載體；

2)按照固相合成方法，逐個偶聯氨基酸；

3)裂解，得到粗肽；

4)粗肽經純化得到Secretin。

步驟1)中所述的固相載體為Rink?Amide樹脂、Rink?Amide-AM樹脂或Rink?Amide-MBHA樹脂等氨基樹脂，樹脂替代度為0.1-0.6mmol/g，優選0.1-0.4，更優選0.15-0.25。

所選擇該樹脂為氨基樹脂，用于C端為酰胺的secretin的合成，易于合成氨基酸及其片段的搭載。

樹脂的替代度由發明人通過大量的實驗篩選得出，當替代度高于0.6mmol/g，偶聯肽鏈較長后會降低偶聯效果；而替代度低于0.6mmol/g，消耗樹脂增多進而使成本上升。