[發明專利]一種利用Flag蛋白標簽沉淀目的蛋白的染色質免疫共沉淀技術

無效

• 申請號: 201310073374.1
• 申請日: 2013-03-08
• 公開（公告）號: CN103146685A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 張玉祥;賴瑞
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/79
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.此項方法是一種利用Flag蛋白標簽沉淀目的蛋白與靶基因的染色質免疫共沉淀(Chromatin?Immunoprecipitation，ChIP)技術，其主要目的是研究轉錄因子，此方法的獨特之處在于：構建一個目的蛋白基因序列連接有Flag蛋白標簽序列的表達載體，將至轉染進特定細胞內，利用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的蛋白與靶基因的DNA-蛋白復合物的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)。

2.根據權利要求1所述的技術方法，其特征在于用Flag蛋白標簽抗體替代目的蛋白抗體進行染色質免疫共沉淀(ChIP)，它的特點是：a.提高了傳統ChIP的特異性；b.減少了抗體的使用。

3.根據權利要求2所述的技術方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)構建目的蛋白基因序列連接有3×Flag蛋白標簽序列的真核表達載體(質粒)；

(2)將構建好的表達載體(質粒)轉染進特定的細胞系中進行表達；

(3)用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的蛋白與其靶基因的DNA-蛋白復合物，其后續操作同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)。

4.根據權利要求3所述的技術方法，其特征在于步驟(1)構建目的蛋白基因序列連接有3×Flag蛋白標簽序列的真核表達載體(質粒)為：

構建一個真核表達載體，其要求：目的蛋白的N端或C端連接有一小段不超過100bp的3×Flag蛋白標簽序列，構建成功的載體表達后目的蛋白的N端或C端帶有一段很短的Flag蛋白標簽，此Flag蛋白標簽可以與Flag蛋白標簽抗體結合，將目的蛋白沉淀下來。

5.根據權利要求3所述的技術方法，其特征在于步驟(2)將構建好的表達載體(質粒)轉染進特定的細胞系中進行表達為：

選定一種要研究的細胞系，將構建好的真核表達載體瞬時轉染或穩定轉染進細胞內進行表達。

6.根據權利要求3所述的技術方法，其特征在于步驟(3)用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的蛋白與其靶基因的DNA-蛋白復合物為：

用甲醛將細胞交聯，其后再進行超聲打碎基因組，再用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的基因與其靶基因的DNA-蛋白復合物，用特定珠子將復合物拽下，最后解交聯回收得到的微量核酸。

7.根據權利要求2所述的技術方法，本方法的特點在于：

a.提高了傳統ChIP的特異性：由于Flag蛋白標簽抗體與蛋白標簽結合的特異性非常好，所以本方法較傳統ChIP的特異性高，能夠減少非特異的背景，提高可信度；

b.減少了抗體的使用：傳統方法需要大量的目的蛋白抗體來提高特異性，此方法能夠減少抗體的使用，節省了一定的費用。