[發明專利]一種利用Flag蛋白標簽沉淀目的蛋白的染色質免疫共沉淀技術

無效

• 申請號: 201310073374.1
• 申請日: 2013-03-08
• 公開（公告）號: CN103146685A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 張玉祥;賴瑞
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/79
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明應用到一種研究DNA與蛋白質相互作用的染色質免疫共沉淀技術(Chromatin?Immunoprecipitation，ChIP)，涉及到構建目的蛋白上帶有Flag蛋白標簽的表達載體并用其抗體沉淀DNA-蛋白復合物的方法。

背景技術

染色質免疫共沉淀技術(ChIP)是一種在體內研究轉錄因子(DNA)與靶基因啟動子區域直接相互作用的方法，可以在體內直接確定它們之間相互作用方式的動態變化，能夠得到轉錄因子結合位點的信息，確定其直接靶基因。此項技術早期多被用于研究核小體上DNA和組蛋白的相互作用以及組蛋白的修飾等方面。近年來，染色質免疫共沉淀技術(ChIP)已經得到了許多改進和完善，成為一種被用于研究體內轉錄調控因子與靶基因啟動子上特異DNA序列相互作用的廣泛使用的技術。ChIP技術已經成為在染色質水平上研究基因表達調控的最為有效的方法。值得一提的是，此項技術與DNA芯片和分子克隆技術相結合，可用于高通量測序篩選已知目的蛋白與其相互結合的靶基因在全基因組上的分布情況。這將有助于尋找出更多的轉錄因子，為研究疾病的發病機制探明道路。

染色質免疫共沉淀技術(ChIP)的原理是：在生理狀態下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原-抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉錄調控的DNA片段，再通過多種下游檢測技術(定量PCR、基因芯片、高通量測序等)來檢測此富集片段的DNA序列。

染色質免疫共沉淀技術(ChIP)的靈敏度最終取決于從未結合的片段背景中分離蛋白質結合的DNA片段的能力，其中抗體的質量和IP步驟是關鍵。然而，蛋白質和基因組DNA的非特異性結合會產生不同種類的背景，這些背景能被交聯捕獲且不受IP步驟改進的影響。因為較短DNA片段的非特異性結合位點較少，所以非特異性結合水平會隨著DNA片段長度的減少而降低。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對在染色質免疫共沉淀中出現的抗體質量差而導致的特異性低的問題而提出的一種全新的方法。

本方法是首先需要構建一個目的蛋白基因帶有Flag蛋白標簽序列的真核表達載體，檢測構建成功的表達載體是否在細胞內表達；其次將構建好的表達載體轉染進特定的細胞內；最后將細胞用甲醛交聯，超聲破碎，用Flag蛋白標簽抗體(而非目的蛋白抗體)去沉淀目的蛋白與下游靶基因的復合物，后續其他步驟同傳統的染色質免疫共沉淀技術。具體地說，本方法包括如下步驟：

1.構建載體：在NCBI上查找出目的蛋白的基因序列，PCR擴增出目的片段，將擴增出的目的片段克隆進一端帶有Flag序列的真核表達載體。

2.檢測構建的載體是否表達：提取質粒，將其瞬時轉染進特定細胞內48小時，提總蛋白做Western?Blot檢測是否表達。

3.將構建好的表達載體轉染進特定細胞內：如果步驟2證明構建的表達載體可以表達，再進行此步驟。根據不同的細胞類型和表達量的不同，選用瞬時轉染或穩定轉染，將構建的表達載體轉染進特定細胞內，待其在細胞內表達量達到預計程度后再進行步驟4。

4.甲醛交聯細胞：本步驟同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)，主要是用甲醛將細胞內的蛋白質-DNA、蛋白質-蛋白質固定下來。

5.超聲破碎：本步驟同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)，主要是用超聲破碎儀將蛋白質-DNA復合物中基因組DNA打碎到一定的長度范圍內，一般情況下是200bp-1kb。

6.用Flag蛋白標簽抗體(而非目的蛋白抗體)去沉淀目的蛋白與下游靶基因的復合物：本步驟是此項方法的核心步驟。傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)是用目的蛋白抗體去沉淀目的蛋白與下游靶基因的復合物，它所存在的最大問題是抗體沉淀的效率低和抗體使用量大，而且抗體非常昂貴，然而，此項方法卻是用Flag蛋白標簽抗體代替目的蛋白抗體去沉淀目的蛋白-下游靶基因復合物。由于Flag蛋白標簽抗體特異性非常好，而且抗體價格昂貴，所以本方法解決了傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)所面臨的抗體效率低和抗體使用量大且昂貴的問題，大大節省了費用。

7.后續操作步驟都同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)。

本方法具有如下的優點和效果：

1.本方法首先是構建了一個過表達體系去做染色質免疫共沉淀，因為提高了目的蛋白在細胞內的表達量，所以可以用來研究細胞內低表達的目的蛋白所調控的下游靶基因位點。