[發(fā)明專利]PCR酶切分型檢測軍團(tuán)菌試劑盒及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310072984.X
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN103184283A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱慶義;胡朝暉;趙利偉;顧全
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種PCR酶切分型檢測軍團(tuán)菌試劑盒，其特征在于：由PCR反應(yīng)液、酶切反應(yīng)液、陰陽性對照品組成；

（1）PCR反應(yīng)液包括：

針對軍團(tuán)菌特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的上游引物和下游引物各36μl

2×PCR?Master?Mix??500μl

雙蒸水dd?H₂O??300～340μl

（2）酶切反應(yīng)液包括：10×酶切緩沖液??40μl

限制性內(nèi)切酶FastDigest?HinfⅠ酶??20μl

雙蒸水dd?H₂O??330～350μl

（3）陰陽性對照品

所述陰性對照為1×10⁴個(gè)菌/ml的大腸桿菌培養(yǎng)物??0.5ml

所述陽性對照為1×10⁴個(gè)菌/ml的嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)物??0.5ml。

2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中針對軍團(tuán)菌特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物中：

上游引物為Leg?557F，其序列為SEQ?ID?NO：1，

下游引物為Leg?557R，其序列為SEQ?ID?NO：2。

3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其應(yīng)用于對軍團(tuán)菌的檢測及鑒定，使用方法為：按照待檢樣品數(shù)n＋2配置反應(yīng)體系，每管取PCR反應(yīng)液45μl，后分別加入提取的待檢基因組DNA模板5μl和陽性對照品和陰性對照品，將上述擴(kuò)增管放到PCR擴(kuò)增儀上，按反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行30～45個(gè)循環(huán)，72℃保溫5min，得擴(kuò)增產(chǎn)物，取5μl?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察記錄結(jié)果，如有557bp條帶，則是陽性軍團(tuán)菌；

取上述陽性PCR產(chǎn)物10μl于PCR管中，加入2?0μl酶切反應(yīng)液，37℃水浴5min后，取8μl?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。嗜肺軍團(tuán)菌可被消化為400bp和157bp片段，而非嗜肺軍團(tuán)菌中的阿德萊德軍團(tuán)菌、釜山軍團(tuán)菌和倫敦軍團(tuán)菌可被消化為約257bp和150bp片段，其他非嗜肺軍團(tuán)菌不被消化，仍為557bp，據(jù)此可區(qū)分嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌。