[發(fā)明專利]PCR酶切分型檢測(cè)軍團(tuán)菌試劑盒及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310072984.X
• 申請(qǐng)日: 2013-03-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103184283A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱慶義;胡朝暉;趙利偉;顧全
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及軍團(tuán)菌檢測(cè)和鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種PCR酶切分型檢測(cè)軍團(tuán)菌的試劑盒。

背景技術(shù)

軍團(tuán)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，廣泛分布在土壤和環(huán)境水系統(tǒng)中。是引起軍團(tuán)菌病的重要病原體。近年來(lái)，軍團(tuán)菌病在世界各地時(shí)有暴發(fā)流行。目前已知軍團(tuán)菌雖有58個(gè)種，70多個(gè)血清型。但臨床上80%以上軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌引起。因此，軍團(tuán)菌尤其是嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前可供使用的軍團(tuán)菌鑒定方法主要包括軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、尿可溶性抗原檢測(cè)、多重PCR檢測(cè)、RT-PCR及基因測(cè)序等。但以上的檢測(cè)方法均存在不足，如直接分離培養(yǎng)，所需時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3～10天，且陽(yáng)性率低；尿抗原檢測(cè)僅對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型具有特異性；生化實(shí)驗(yàn)對(duì)于大量菌株的分類鑒定繁瑣費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確性較差；血清學(xué)檢測(cè)成本高昂，且易產(chǎn)生交叉反應(yīng)；多重PCR檢測(cè)特異性較差；基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的雜交探針標(biāo)記技術(shù)價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜；DNA測(cè)序是最為準(zhǔn)確的軍團(tuán)菌種鑒定方法，但耗時(shí)較長(zhǎng)，分析困難。因此，基于以上方法建立的各種試劑盒也存在各種不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，基于在16S?rRNA基因片段中的一個(gè)嗜肺軍團(tuán)菌特異酶切位點(diǎn)，建立一種新型的PCR-酶切技術(shù)檢測(cè)軍團(tuán)菌試劑盒，可以更為簡(jiǎn)單、快速、有效的對(duì)軍團(tuán)菌及嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種PCR酶切分型檢測(cè)軍團(tuán)菌試劑盒，由PCR反應(yīng)液、酶切反應(yīng)液、陰陽(yáng)性對(duì)照品組成；

（1）PCR反應(yīng)液包括：

針對(duì)軍團(tuán)菌特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的上游引物和下游引物各36μl

2×PCR?Master?Mix??500μl

雙蒸水dd?H₂O??300～340μl

（2）酶切反應(yīng)液包括：10×酶切緩沖液??40μl

限制性內(nèi)切酶FastDigest?HinfⅠ酶??20μl

雙蒸水dd?H₂O??330～350μl

（3）陰陽(yáng)性對(duì)照品

所述陰性對(duì)照為1×10⁴個(gè)菌/ml的大腸桿菌培養(yǎng)物??0.5ml

所述陽(yáng)性對(duì)照為1×10⁴個(gè)菌/ml的嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)物??0.5ml。

進(jìn)一步地，其中針對(duì)軍團(tuán)菌特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物中：

上游引物為L(zhǎng)eg?557F，其序列為SEQ?ID?NO：1，

下游引物為L(zhǎng)eg?557R，其序列為SEQ?ID?NO：2。

PCR酶切分型檢測(cè)軍團(tuán)菌試劑盒應(yīng)用于對(duì)軍團(tuán)菌的檢測(cè)及鑒定，使用方法為：

按照待檢樣品數(shù)n＋2配置反應(yīng)體系，每管取PCR反應(yīng)液45μl，后分別加入提取的待檢基因組DNA模板5μl和陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，將上述擴(kuò)增管放到PCR擴(kuò)增儀上，按反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行30～45個(gè)循環(huán)，72℃保溫5min，得擴(kuò)增產(chǎn)物，取5μl?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察記錄結(jié)果，如有557bp條帶，則是陽(yáng)性軍團(tuán)菌；

取上述陽(yáng)性PCR產(chǎn)物10μl于PCR管中，加入2?0μl酶切反應(yīng)液，37℃水浴5min后，取8μl?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。嗜肺軍團(tuán)菌可被消化為400bp和157bp片段，而非嗜肺軍團(tuán)菌中的阿德萊德軍團(tuán)菌、釜山軍團(tuán)菌和倫敦軍團(tuán)菌可被消化為約257bp和150bp片段，其他非嗜肺軍團(tuán)菌不被消化，仍為557bp，據(jù)此可區(qū)分嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基于嗜肺軍團(tuán)菌特異性酶切位點(diǎn)“GANTC”，建立一種新型的PCR-酶切分析檢測(cè)試劑盒，同傳統(tǒng)的試劑盒在PCR反應(yīng)、酶切反應(yīng)及結(jié)果判定上完全不同。此外，與先前的試劑盒相比本試劑盒具有電泳片段大結(jié)果更易觀察、所用的FastDigest?HinfⅠ酶成本更加低廉、反應(yīng)時(shí)間更短，僅需5min的優(yōu)勢(shì)。而相比其它的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒對(duì)儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單，具備PCR高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，且成本低廉、方便快速，無(wú)須DNA抽提便可對(duì)環(huán)境水樣及其它樣品中分離的可疑軍團(tuán)菌進(jìn)行快速檢測(cè)鑒定，具有很高的實(shí)用性。適合于土壤和環(huán)境水樣標(biāo)本及其它樣本中軍團(tuán)菌的檢測(cè)。

本發(fā)明的軍團(tuán)菌及嗜肺軍團(tuán)菌新檢測(cè)試劑盒，其主要特點(diǎn)如下：

（1）高特異性：本發(fā)明通過(guò)對(duì)16株嗜肺軍團(tuán)菌（包括15個(gè)血清型）、22株非嗜肺軍團(tuán)菌及12株其它非軍團(tuán)菌進(jìn)行基因分型檢測(cè)，該試劑盒能準(zhǔn)確的鑒定出軍團(tuán)菌及嗜肺軍團(tuán)菌，說(shuō)明該檢測(cè)試劑盒特異性很高；