[發(fā)明專利]用于檢測(cè)玉簪屬植物病毒X的引物組及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310072636.2
• 申請(qǐng)日: 2013-03-07
• 公開（公告）號(hào): CN103131799A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張永江;辛言言;魏梅生;馬潔;朱水芳;李桂芬;李曼
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢疫鑒定技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)玉簪屬植物病毒X的引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

玉簪屬植物病毒X（Hosta?virus?X，HVX）為甲型線形病毒科（Alphaflexiviridae）馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）病毒，是一種專門侵染玉簪屬植物（Hosta?Tratt）的病毒，可導(dǎo)致玉簪（H.plantaginea?Aschers.）和紫萼（H.ventricosa?Stearn）等玉簪屬植物花葉、斑駁及葉片脫水等癥狀。HVX可以通過種子、苗木以及園藝工具等途徑傳播。目前已見HVX報(bào)道的國(guó)家有荷蘭、法國(guó)、韓國(guó)、美國(guó)。HVX傳入美國(guó)后，已經(jīng)對(duì)美國(guó)玉簪屬植物造成了嚴(yán)重危害，產(chǎn)品損失巨大，嚴(yán)重影響到玉簪屬植物的經(jīng)濟(jì)效益。美國(guó)已將HVX列為限定性非檢疫性有害生物。為支持美國(guó)國(guó)內(nèi)健康苗木計(jì)劃（clean?stock?program），美國(guó)本土的玉簪屬植物產(chǎn)品正朝著無(wú)HVX侵染的方向發(fā)展，為了響應(yīng)HVX侵染導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響及支持國(guó)內(nèi)健康苗木計(jì)劃，美國(guó)動(dòng)植物檢疫局（簡(jiǎn)稱APHIS）正在制定符合國(guó)內(nèi)形勢(shì)的玉簪屬植物進(jìn)口要求，APHIS將在進(jìn)口港對(duì)所有進(jìn)口的玉簪屬植物材料進(jìn)行HVX檢測(cè)，若HVX侵染率高于5%則禁止進(jìn)入。

玉簪屬植物原產(chǎn)我國(guó)和日本，在我國(guó)分布甚廣，其中玉簪（H.plantaginea?Aschers.）和紫萼（H.ventricosa?Stearn）等美麗的庭園觀賞植物，多年來(lái)保持著良好的對(duì)外出口記錄。為了保護(hù)我國(guó)的花卉產(chǎn)業(yè)，國(guó)家質(zhì)檢總局發(fā)出HVX的疫情警示，提醒廣大花卉苗木進(jìn)出口企業(yè)及各口岸檢疫局，應(yīng)加強(qiáng)HVX的專項(xiàng)檢測(cè)，以消除隱患，確保我國(guó)花卉安全生產(chǎn)，同時(shí)促進(jìn)我國(guó)的花卉出口。為了有效提高檢測(cè)效率，需要建立相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)。

目前在玉簪屬植物病毒X的檢測(cè)上，較常用的方法有兩種，一種是血清學(xué)檢測(cè)方法，常見的有DAS-ELISA，血清學(xué)檢測(cè)方法除了在靈敏度上存在不足外，其檢測(cè)的特異性也受到限制（同屬成員間的檢測(cè)往往有交叉反應(yīng)）；另一種是分子生物學(xué)檢測(cè)方法，其中以RT-PCR最為常見，但是PCR需要特殊的儀器（PCR儀）。同時(shí)兩者的檢測(cè)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，血清學(xué)方法大約需要2天，分子生物學(xué)方法大約需要5小時(shí)，無(wú)法滿足口岸快速檢疫的要求。

環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediatedisothermal?amplification，LAMP），是由Notomi?T等在2000年發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，它是一種高靈敏的鏈置換技術(shù)。LAMP特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶-Bst?DNA?polymerase在恒溫（60℃-65℃）的條件下反應(yīng)0.5-1小時(shí)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過熒光染色直接目測(cè)比色就可以得到清晰的反應(yīng)結(jié)果。不需要長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)，不需要PCR儀等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)植物各種病毒、細(xì)菌及寄生蟲等引起的疾病檢測(cè)和快速診斷，且一些已獲得專利授權(quán)，如在植物病毒上的有：一種利用LAMP快速檢測(cè)中國(guó)番木瓜曲葉病毒的方法（申請(qǐng)?zhí)枺?01110119658.0；授權(quán)公告號(hào)：CN102154526B）、利用RT-LAMP方法快速檢測(cè)植株中水稻黑條矮縮病毒（申請(qǐng)?zhí)枺?01110071894.X；授權(quán)公告號(hào)：CN102154518B）、利用RT-LAMP方法快速檢測(cè)飛虱體內(nèi)水稻黑條矮縮病毒（申請(qǐng)?zhí)枺?01110071930.2；授權(quán)公告號(hào)：CN102168151B）等。

LAMP方法由于具有反應(yīng)時(shí)間短、無(wú)需特殊儀器、檢測(cè)靈敏度高及特異性好的優(yōu)點(diǎn)，很好的克服了當(dāng)前所用DAS-ELISA及RT-PCR兩類方法的不足，目前尚未見到使用該方法檢測(cè)玉簪屬植物病毒X的報(bào)道。LAMP方法既保證了檢測(cè)的靈敏性和特異性，同時(shí)又簡(jiǎn)化了操作，節(jié)省了成本，為進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫提供了一種簡(jiǎn)單而有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)玉簪屬植物病毒X的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組。

本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)玉簪屬植物病毒X的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，可為引物組A或引物組B；所述引物組A具體由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B具體由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；

所述引物1（F3）、所述引物2（B3）、所述引物3（FIP）、所述引物4（BIP）、所述引物5（LF）和所述引物6（LB）的的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。