[發明專利]應激條件提高茂原鏈霉菌生產谷氨酰胺轉氨酶產量的方法

無效

• 申請號: 201310072023.9
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN103146660A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 張蘭威;張莉麗;易華西;單毓娟;馮鎮;杜明;韓雪;張英春;李洪波;焦月華
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12R1/465
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及鏈霉菌發酵生產谷氨酰胺轉氨酶技術領域，具體涉及一種采用應激條件提高發酵法制備谷氨酰胺轉氨酶的方法。

背景技術

谷氨酰胺轉氨酶（Transglutaminase，簡稱TGase，EC?2.3.2.13，R-glutaminyl-?peptide：amnie-γ-glutamyl-transferase）又名轉谷氨酰胺酶，它通過催化蛋白質中的谷氨酸殘基上的甲酰胺與賴氨酸殘基上的ε-氨基進行酰基轉移反應，使蛋白質在分子內或分子間形成交聯。

在二十世紀八十年代，Ikura等人報道了谷氨酰胺轉氨酶對食物蛋白質的交聯作用。他們用哺乳動物源谷氨酰胺轉氨酶交聯幾種食物蛋白質，如酪蛋白、大豆蛋白等。這些蛋白的交聯，提高了其產品的功能性，如凝膠性、溶解性和乳化性等。然而，由于其高昂的價格和低效的利用率限制了它在食品工業上的應用。從鏈霉菌中成功分離到微生物源谷氨酰胺轉氨酶是促進其在食品工業上應用的一個里程碑。它使得這種酶可以大規模地生產，并且被商業利用。由于鏈霉菌谷氨酰胺轉氨酶底物的催化特性，以及它在食品、紡織和醫藥行業中的廣闊應用前景，受到了國內外學者的廣泛關注，在亞洲的日本、臺灣，歐洲的丹麥、荷蘭、法國、德國、愛爾蘭以及巴西等國家均投入了大量的人力、物力、財力進行研究，并取得了突飛猛進的進展。

谷氨酰胺轉氨酶的來源主要有3種：一是從動物的組織或體液中提取，例如牛、豬或魚等，由于動物組織種類有限、來源稀少、含量低、組織特異性又極高，而且分離精制過程復雜，價格十分昂貴；在歐洲，商業化的凝血因子XIII（谷氨酰胺轉氨酶的一種）主要通過宰殺牛或豬等動物來獲得，但由于血液中的谷氨酰胺轉氨酶通常需要凝血酶激活才具有活性，故很少應用于食品工業中。二是以大腸桿菌、棒狀桿菌和鏈霉菌等為宿主，用基因工程手段來生產此酶。基因工程菌表達效果較差，遠不能達到原有水平；雖然有些報道產量較高，但某些國家對基因工程產品限制比較嚴格。三是直接篩選產谷氨酰胺轉氨酶的微生物，通過發酵法來生產。由于此方法技術可行、成本較低、生產不受出發材料和季節限制，最有可能進行大規模生產和廣泛應用。但是目前食品級谷氨酰胺轉氨酶來源單一、產量較低、價格昂貴，限制了其在食品工業上的應用。

國內外提高微生物谷氨酰胺轉氨酶產量的報導大多集中在優化發酵條件，改善培養基組成等方面。雖然這些研究都取得了一些成果，但是此酶的產量仍然較低。目前商業化的產品主要由日本味之素等公司生產。國內用微生物發酵法生產谷氨酰胺轉氨酶尚處于起步階段，產量較低。

發明內容

針對現有谷氨酰胺轉氨酶的制備方法存在的問題，本發明提供一種應激條件提高茂原鏈霉菌生產谷氨酰胺轉氨酶產量的方法。

本發明的發明目的是通過如下技術方案實現的：

采用茂原鏈霉菌為發酵菌株，經斜面培養和種子培養后，接種在發酵培養基中經液體發酵制備谷氨酰胺轉氨酶，在發酵過程中分別通過熱處理培養物、在發酵培養基中添加甲醇或NaCl，發酵96h，最終實現了提高谷氨酰胺轉氨酶產量的目標。

具體技術方案如下：

1、菌種及發酵培養液：

（1）菌種：

茂原鏈霉菌（Streptomyces?mobaraense）DSM40587：購于日本NBRC。

（2）斜面培養基（g/L）：高氏一號培養基。

（3）種子培養基（g/L）：聚蛋白胨20，可溶性淀粉20，磷酸氫二鉀2，磷酸二氫鉀2，酵母粉2，無水硫酸鎂2，pH?7.0。

（4）初始發酵培養基（kg/1000L）：聚蛋白胨30，可溶性淀粉10，果糖10，磷酸氫二鉀2，酵母粉2，無水硫酸鎂1，pH?7.0。

2、谷氨酰胺轉氨酶酶活的測定方法：

采用分光光度法37?℃下測定。吸取50μL發酵液，加入0.5mL試劑A，37℃水浴保溫10min，加入0.5mL試劑B，終止反應，500nm比色。

試劑A：100mg的N-CBZ-Gln-Gly溶解于2mL、0.2mol/L的NaOH，依次加入0.2mol/L、pH?6.0的Tris-HCl緩沖液4mL，0.1mol/L的羥胺2mL，0.01mol/L的還原型谷胱甘肽2mL，并調節pH至6.0。

試劑B：3mol/L鹽酸、12%三氯乙酸、5%FeCl₃·6H₂O（溶解于0.1mol/L的鹽酸）按1:1:1的比例混合。