[發明專利]金屬硫蛋白轉基因酵母的構建及利用其制備重金屬生物吸附材料的方法

有效

• 申請號: 201310071946.2
• 申請日: 2013-03-07
• 公開（公告）號: CN103205454A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 陳麗杰;王曉珊;袁文杰
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C02F1/58;C12R1/865;C02F101/20
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

技術領域

本發明屬于環境工程重金屬污染治理領域，涉及一種利用金屬硫蛋白改造的轉基因酵母及制備重金屬生物吸附劑的方法。

背景技術

重金屬污染是當今世界非常嚴重的環境問題之一，重金屬污染主要由于現代工農業的發展及人類一些不良處理方法導致，對生態環境、公共衛生及人類健康都構成了嚴重的威脅。不同于其他污染，重金屬污染不能夠被生物降解，因此使得重金屬污染的治理更加困難。當前，處理重金屬污染主要是利用物理或者化學的方法，包括化學沉淀、離子交換、膜分離、反滲透等。但是這些方法都存在著能耗高，運行費用大，操作復雜，在處理低濃度重金屬廢水時效率低等問題，所以很難實現大規模應用，并且物理化學方法在應用過程中還容易引起水體和土壤的二次污染。因此，除了要在源頭上通過應用清潔生產技術對重金屬的使用和排放進行遏制之外，還需要更多地研究和開發成本低、效率高的新型吸附材料對重金屬污染進行治理。

生物吸附法作為一種新興的重金屬污染處理方法越來越突顯出其獨特的優勢。生物吸附法主要是將生物資源通過一定的預處理，制成穩定的，可以有效地分離有毒重金屬的生物吸附材料，其具有成本低，來源廣泛，無二次污染等優點，尤其在處理大體積低濃度廢水時，生物吸附法具有高效、廉價、環境友好的特點，非常適用于工業廢水的處理。生物吸附重金屬的主要機制是通過鰲合、離子交換、氧化還原等機理。與物理化學方法相比，生物吸附法更符合可持續發展的環境經濟發展戰略，是一種極具潛力的重金屬處理方法。

自然狀態下生長良好并具有高生物量產率的微生物，往往具有較低的重金屬吸附能力和耐受能力，不適合應用于重金屬環境治理。因此，隨著基因工程技術的發展，人們嘗試對微生物進行遺傳改造，把一些天然金屬螯合蛋白或多肽在細胞內表達使轉基因重組菌株對重金屬具有高抗性和高富集能力，然后利用轉基因工程菌對重金屬污染進行高效修復。在眾多金屬螯合蛋白中，廣泛存在于生物體內、對生物體具有重金屬解毒、清除自由基功能的金屬硫蛋白備受關注。金屬硫蛋（metallothionein）是一類低分子量（7-10kDa）、富含半胱氨酸（20-30%）的金屬結合蛋白。最早由哈佛大學的Margoshes和Valee于1957年從馬的腎臟中首次分離得到，此后在動物、植物、微生物等均發現有金屬硫蛋白并相繼分離得到。金屬硫蛋白屬于在進化上比較保守的蛋白，其結構高度保守，不同來源的金屬硫蛋白氨基酸序列很相似，均由61個氨基酸組成，并且其中大概20個為半胱氨酸，賴氨酸和絲氨酸也比較多，但完全不含芳香族氨基酸和組氨酸。肽鏈的羧基末端都是丙氨酸，氨基末端都是N-乙酰甲硫氨酸。多肽鏈中的氨基酸多數是排列為Cys-X-Cys的重復結構，由于Cys中的巰基對金屬離子具有很強的螯合能力，金屬硫蛋白對Cd、Zn、Cu有很高的親和力。金屬硫蛋白的空間結構研究顯示金屬硫蛋白內不含二硫鍵和游離的巰基，主要靠Cys的巰基來連接金屬。每20個Cys可以結合12個Cu，或者7個Zn、Cd，對不同的金屬親和力不同，其穩定性次序為：Hg、Ag>Cu>Cd>Zn，可以同時吸附污水中的多種重金屬。因此，金屬硫蛋白作為一種金屬結合蛋白，在重金屬污染處理領域具有很大的應用潛力。

發明內容

本發明目的在于克服現有物理化學技術在處理重金屬污染問題時存在的運行費用大，能耗高，二次污染嚴重等缺點，提供一種經濟、安全的利用金屬硫蛋白轉基因酵母制備的重金屬生物吸附材料的方法。

本發明是采用如下技術方案實現的：

金屬硫蛋白轉基因酵母的構建方法如下：金屬硫蛋白基因來源于S.cerevisiae288c，將從釀酒酵母S.cerevisiae288c中克隆的金屬硫蛋白基因連接到pFA6a載體上，再將S.cerevisiae288c3‐磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）啟動子拼接到載體上，利用S.cerevisiae288c3‐磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）啟動子進行表達，最后將S.cerevisiae288c?rDNA基因作為同源臂連接到上述載體上，利用rDNA在酵母細胞內存在100‐200個重復單元的特點，以rDNA作為同源整合位點實現目的基因的多拷貝整合表達，從而得到具有重金屬吸附功能的多拷貝整合表達載體pFA6a‐PGK1‐cup1‐rDNA，將其線性化后轉化釀酒酵母S.cerevisiae4126，利用G418為篩選標記，即可篩選到金屬硫蛋白轉基因酵母，將該轉基因酵母命名為S.cerevisiae4126‐cup1。