[發(fā)明專利]檢測人巨細(xì)胞病毒或其啟動子的熒光絕對定量PCR試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310070654.7
• 申請日: 2013-03-06
• 公開（公告）號: CN103215376A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 苗玉發(fā);李波;沈連忠
• 申請（專利權(quán)）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種檢測人巨細(xì)胞病毒啟動子或檢測含人巨細(xì)胞病毒啟動子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，屬于人巨細(xì)胞病毒或其啟動子的檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人類巨細(xì)胞病毒(human?cytomegalovirus，HCMV)的感染對人類健康造成嚴(yán)重威脅。HCMV幾乎可以感染所有器官，它的感染一方面使細(xì)胞吞噬溶解功能、抗原呈遞功能、分泌抗病毒細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)因子的功能顯著降低；另一方面通過抑制Th功能或下調(diào)感染細(xì)胞MHC-I類抗原表達(dá)，使被感染個體免疫功能下降。在感染發(fā)生過程中極早期啟動子(major?immediate?early?enhancer/promoter，MIEP)是病毒和宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用的通信接口。人巨細(xì)胞病毒啟動子能指導(dǎo)基因在大多數(shù)的體外培養(yǎng)細(xì)胞中瞬時/穩(wěn)定表達(dá)，是啟動真核基因表達(dá)的強(qiáng)力啟動子，該啟動子參與構(gòu)建的高效真核表達(dá)載體廣泛應(yīng)用于基因治療產(chǎn)品和DNA疫苗的制備。

人巨細(xì)胞病毒感染廣泛存在、發(fā)病率高、危害大，尤其對于孕產(chǎn)婦、嬰幼兒以及器官移植患者。對于HCMV感染患者就需要早診斷、早治療，方法選擇顯得很重要。此外，也需要一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的定量檢測方法用于人巨細(xì)胞病毒(HCMV)基因疫苗的研制及其預(yù)防和治療HCMV原發(fā)和再發(fā)感染效果的評價。

病毒分離為最準(zhǔn)確方法，是金標(biāo)準(zhǔn)。但耗時長，技術(shù)要求高，不適合臨床推廣。血清學(xué)檢測雖然簡便，但不適于早期檢測及對HCMV感染狀況的評價。以熒光標(biāo)記探針為基礎(chǔ)的實時熒光定量PCR技術(shù)，在目前國內(nèi)的臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛。在探針法的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系中往往包括一對或多對特異性PCR引物及探針，通過研發(fā)過程中的條件摸索，探針及引物只與相對應(yīng)的模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter，R)，如FAM、VIC、ROX等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。

迄今為止，用于檢測人巨細(xì)胞病毒或含有人巨細(xì)胞病毒啟動子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒均不同程度的存在特異性差、靈敏度低、檢測線性范圍較窄等缺陷，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是提供一種能夠準(zhǔn)確的檢測人巨細(xì)胞病毒或檢測含有人巨細(xì)胞病毒啟動子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，該檢測試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測線性范圍廣等優(yōu)點。

本發(fā)明的主要目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種檢測人巨細(xì)胞病毒或檢測含有人巨細(xì)胞病毒啟動子的基因治療產(chǎn)品的熒光定量PCR試劑盒，包括以下各組分：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液，特異性引物對，熒光標(biāo)記的探針和雙蒸水；所述的特異性引物對由SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的引物組成；所述的探針的核苷酸序列為SEQ?ID?No.3所示。

其中，在探針的5′端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，所述的熒光報告基團(tuán)是FAM、HEX或ROX熒光報告基團(tuán)，優(yōu)選為FAM熒光報告基團(tuán)；在探針的3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)可以是TAMRA、BHQ1或BHQ2等熒光淬滅基團(tuán)，優(yōu)選為TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。

其中，所述的熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液包括：Taq?DNA聚合酶、PCR緩沖液、Mg²⁺、dNTPs；

為了得到絕對定量結(jié)果，所述的試劑盒中還包含有人巨細(xì)胞病毒啟動子質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。所述人巨細(xì)胞病毒啟動子質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可通過商業(yè)途徑購買得到，也可參照以下方法構(gòu)建得到：在pUC57質(zhì)粒的Sam?I酶切位點插入SEQ?ID?No.4所示的基因片段，即得。

本發(fā)明試劑盒中各組分的用量可根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量以及每次熒光定量PCR反應(yīng)所需的用量來確定或進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，這些都是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員視檢測情況或?qū)嶋H需要很容易就能確定的參數(shù)。

作為參考，采用本發(fā)明熒光定量PCR試劑盒檢測人巨細(xì)胞病毒或含有人巨細(xì)胞病毒啟動子的基因治療產(chǎn)品的PCR反應(yīng)條件和PCR反應(yīng)體系如下：