[發明專利]突變型OsGBSS1酶及其制備方法與用途

有效

• 申請號: 201310069961.3
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN103695381A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 蔡秀玲;劉德瑞
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/82;C12N15/84;C12N5/10;A01H5/00;A01H5/10;C12Q1/48
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

技術領域

本發明涉及酶學領域。具體地說，本發明涉及突變型OsGBSS1(顆粒結合淀粉合成酶1,2.4.1.242)以及利用該酶改善大米中直鏈淀粉含量的方法及其應用。

背景技術

禾谷類作物是我國的主要糧食作物。其中，水稻(Oryza?sativa)是重要的禾谷類作物，有秈粳之分，秈包括秈稻和秈糯，粳包括粳稻和粳糯。稻米供人類食用的主要部分是胚乳中的淀粉，淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉。糯稻與非糯稻的區別在于胚乳的淀粉組成比例不同，非糯型的水稻直鏈淀粉含量較高，在10-30wt%之間；糯型的水稻直鏈淀粉含量則低于3wt%。在表觀上非糯型的米粒色澤呈透明或淺透明狀，用碘-碘化鉀對米粒橫切面進行染色，呈蘭色；糯型的米粒色澤呈蠟質狀，用碘-碘化鉀染色，呈橙黃色。水稻胚乳中的直鏈淀粉含量和膠稠度是稻米品質評價中的重要指標。

直鏈淀粉是在ADP-Glc焦磷酸化酶(AGPase)和Wx基因編碼的OsGBSS1[1,2]的作用下合成的。Wx基因的表達水平、OsGBSS1的活性與AC呈顯著正相關[1,3,4]。根據直鏈淀粉含量的不同一般將水稻分為四類：極低直鏈淀粉含量品種、低直鏈淀粉含量品種、中等直鏈淀粉含量品種和高直鏈淀粉含量品種[5]。

影響大米蒸煮和食用品質的關鍵因素包括：直鏈淀粉含量(AC)、膠稠度以及糊化溫度[6]。這其中膠稠度和糊化溫度兩項參數也與直鏈淀粉含量有一定的相關性，因為這兩項流變力學特征決定于支鏈淀粉結構，尤其是短支鏈與長支鏈的比例[7]。OsGBSS1同時負責支鏈淀粉中超長鏈的延伸[8]。所以，通過調節Wx基因的表達或活性水平可以在影響AC的同時，決定蒸煮和食用品質的不同。

一般而言，高直鏈淀粉含量的稻米其食用品質會降低，而這一現象也廣泛存在于在中國種植的雜交秈稻中。研究人員正努力在降低大米AC保證食用品質的同時保證其高產。目前有三種降低AC的方法。(1)通過引入反義鏈降低WxmRNA的表達量[9,10]；(2)通過調節啟動子的活性。例如利用dsRNAi方法抑制一個可以結合到Wx基因啟動子上的一段特異31bp片段上的轉錄因子OsBP-5來達到降低OsGBSS1表達的目的[11]；(3)降低Wx基因pre-mRNA的剪接效率。例如將剪接因子du-1或du-2突變后，由于Wx的異常剪接造成OSGBSS1成熟蛋白質含量降低，直接造成直鏈淀粉含量降低[12,13]。RNA介導的RNA沉默機制的發現并應用，為包括直鏈淀粉含量的控制提供了一種直接途徑。但通過dsRNAi對基因表達的抑制作用只能定性而并不能精確地對其產生的作用進行定量，這也在一定程度上阻礙了其在水稻育種品質改良上的應用。此外，上述方法都建立在Wx的表達在轉錄和轉錄后受到調控的理論基礎上，并沒有系統研究直接改變OsGBSS1酶活性的諸方面。

自然界的眾多水稻品種提供了一個很大的水稻品質庫，Wx基因在眾多水稻品種中也存在很多自然突變。Wx基因本身存在產生不同突變進而影響水稻淀粉品質的潛能[4]。由于這些水稻品種之間存在遺傳背景上的不同，因此這些自然突變是否就是造成它們之間AC不同的唯一原因就不得而知。

因此，為本領域急需從OsGBSS1本身入手，系統研究如何改變其活性，例如通過突變其氨基酸序列改變其活性，進而改善水稻以及所得大米的品質。

發明內容

本發明的目的在于提供一種活性改變的顆粒結合淀粉合成酶并揭示特定氨基酸殘基與直鏈淀粉含量的關系，進而用于調節水稻中直鏈淀粉含量以及改善稻米的食用品質。

在第一方面，本發明提供一種顆粒結合淀粉合成酶，所述酶在對應于SEQ?IDNO:1所示氨基酸序列的一個或多個選自下組的氨基酸位點中發生突變：

(a)H236、N265、Y268、N353、R408、E410、K413或C487；

(b)A114、EA314-315或T543；或

(c)上述(a)或(b)的任意組合。

在優選的實施方式中，所述突變是選自下組的突變：(1)非極性氨基酸替代極性氨基酸，優選以A替代；(2)改變主鏈的碳鏈長度；或(3)改變氨基酸上的R基團。

在另一優選的實施方式中，所述突變是：H236Y、N265D、Y268F、Y268W、N353A、R408A、E410D、E410Q、C487A、K413A、A114S、EA314-315QT或T543A。

在優選的實施方式中，所述顆粒結合淀粉合成酶的比酶活降低10%-100%。