[發明專利]一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310069078.4
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN103242435A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 李萬波;黃勇;陜婧婧;管春愛;賈翔
• 申請（專利權）人: 盤古基因科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C07K14/36
• 分類號: C07K14/36;C12N15/31;C12N15/70;C12R1/465
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 姚姣陽

技術領域

本發明屬于基因工程、蛋白質工程和發酵工程領域，涉及一種DNA分子的合成、突變、重組和載體構建技術，尤其涉及一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法。?

背景技術

鏈霉親和素（Streptavidin，SA）是由阿維丁鏈霉菌（Streptomyces?avidinii）培養過程中分泌的一種小分子非糖基化蛋白質，全長編碼區183個氨基酸（aa），包含24aa的信號肽（見序列表中SEQ?ID?No:?1），成熟分子159aa?(見序列表中SEQ?ID?No:?2)。菌體外的天然活性形式為從13～139aa的成熟肽(見序列表中SEQ?ID?No:?3)，分子量15kD，其天然形式為同源四聚體，分子量60kD，SA的成熟活性結構為127個氨基酸的多肽，稱為SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr.?Stapley首先發現并報道。?

本世紀以來，SA由于其與生物素（Biotin，又稱維生素H、輔酶R）有極高的親和力和特異性而受到國際生物學和醫學界的高度重視。SA對其配體生物素的親和力（10^-16?M/L）比已知的抗原-抗體的親和力（10^-7～10^-12?M/L）高4～6個數量級。高親和力和高特異性并不是SA的唯一特性，SA與Biotin的結合速度極快，即便是在極低濃度和4℃環境下也是如此。另外，由于生物素是小分子，因而蛋白生物素化幾乎不影響生物功能。SA-Biotin復合物可以耐受變性劑（如6M鹽酸胍）、去垢劑（如SDS）、90℃高溫和3～11pH環境。與其他靶向標簽（如Halo-Tag和SNAP-Tag）相比，SA有更多便利，不論是體外或體內，其可借助大腸桿菌的生物素連接酶（E.?coli?biotin?ligase）將其配體標記到目標蛋白。SA的這些特性，引發了科學家對SA和其配體Biotin進行各種生物改造的興趣。?

野生型SA（wtSA）分子與Biotin的結合速度（on-rate）雖然很快，但結合力不夠穩定持久（high?off-rate），這對需要連續長時間觀察的動態實驗（如細胞生物學領域）與影像研究較為不利。另一方面，wtSA與生物素的異乎尋常的親和力（10^-16mole/L），又使得分離制備時，需要變性條件下洗脫。盡管wtSA對生物素的親和力極高，但其對某些極具用途的生物素衍生物，如2-亞氨基生物素，則結合力不夠理想（兼容性不理想），這也提出了對SA進行分子改造的必要。?

盡管過去20年來，已經報道有200多種突變型SA（mtSA），但關于SA突變后提高結合穩定性的研究很少。2012年，Mark?Howarth，Oxford?（GB）公開了穩定性結合SA突變體研究（美國專利申請號:?US?2012/0214970?A1），測試并保護了3個雙位點突變體S52G/R53D，S52G/R53N，S52G/R53S?（見序列表中SEQ?ID?No:?4，SEQ?ID?No:?5，SEQ?ID?No:?6），指出該類突變體的主體序列必須在第23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128與野生型SA相同。?

早在2000年，R.?Charles?Cantor（Boston?University）對SA的親和兼容性進行了研究，公開了2個SA的突變體（EP0977770?A1），它們是N23A、S27E或S27D（見序列表中SEQ?ID?No:?7，SEQ?ID?No:?8），該突變體對Biotin的親和力降低了至少10個數量級，提高了對2-亞氨基生物素（2-iminobiotin）和?Diaminobiotin的親和力，可用于分離2-亞氨基生物素化的蛋白。?

發明內容

鑒于上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提出一種全人工基因合成的密碼子優化和突變引入的親和兼容性鏈霉親和素突變體SA128m4及其制備方法，親和兼容性鏈霉親和素突變體SA128m4既有兼容性親和力，又有低的解離速度（off-rate）。?

本發明的目的將通過以下技術方案得以實現：?

一種親和兼容性鏈霉親和素突變體，所述親和兼容性鏈霉親和素突變體的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:10所示。

優選的，上述的一種親和兼容性鏈霉親和素突變體，其中：所述親和兼容性鏈霉親和素突變體包含4個氨基酸的突變，分別為Y22N、N23Y、S52G、R53D。?