[發明專利]一種熒光定量檢測羥基自由基的方法

有效

• 申請號: 201310069048.3
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN103149188A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 張煊;司芳;閻克路
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

技術領域

本發明涉及一種熒光定量檢測羥基自由基的方法，特別是涉及一種以苯五甲酸為熒光探針的熒光定量檢測羥基自由基的方法。

背景技術

活性氧是指比分子狀態氧（空氣中存在的氧）反應性更活潑的、含有氧原子的分子或自由基，如羥基自由基(HO^·)、超氧陰離子自由基(O₂^-·)、單線態氧(¹O₂)及過羥基自由基(HOO^·)等?；钚匝醯臏y試涉及各個領域，包括紡織化學、造紙制漿、醫學、食品、環境中。在上述含氧類自由基中,羥基自由基是水溶液中最強的氧化劑之一，可引發誘導產生鏈反應,主要通過電子轉移、親電加成、脫氫反應等途徑無選擇性地與各種有機化合物直接作用并最終將其降解為CO₂、H₂O等無害物質。

目前檢測羥基自由基的方法主要包括分光光度法、電子自旋法(ESR)、化學發光法、電化學法、高效液相色譜法(HPLC)等(Zhou?KQ,et?al.,Food?Chem.2006,95:446-457;Christopher?J.,et?al.,Anal.Chem.2011,83:261-268;Kilinc?E.,et?al.,Talanta,2005,65:876-881;Chao?T,et?al.,Anal.Chim.Acta2004,527:73–80;吳峰等，專利CN1412553A,2003-4-23)，但以上檢測大部分在標準體系中進行，且都有不可避免的缺陷，難以實現快速準確檢測。分光光度法儀器易為一般實驗室采用，但測定的準確性較差，靈敏度較低，專一性不強；ESR儀器成本較高，靈敏度低，專一性不強；化學發光法經常產生人工活性氧干擾結果；電化學檢測則有電極面積及定位的限制，抗干擾能力不強，選擇性差，應用范圍有限；高效液相色譜法(HPLC)操作復雜耗時，且固定相的存在會引起自由基的各種反應而使自由基猝滅。熒光分析法(Peter?W.,et?al.,Free?Radical?Bio.Med.,2007,43:995-1022)具有簡單快速、靈敏度高、易于實現自動化、可視化和在線檢測等特點，而且儀器廉價，在一般實驗室中較常見，因此近年來在羥基自由基檢測中備受關注。

熒光分析法檢測羥基自由基的體系一般都需選用捕獲劑，利用捕獲劑與羥基自由基反應后底物熒光強度的改變，實現間接測定活性氧的濃度。目前采用的捕獲劑有水楊基熒光酮(任鳳蓮等，分析化學，2001,29(1):60-62)和羅丹明6G(Jing?F,et?al.,J.Fluoresc.,2007,17:257–264)等熒光染料，利用羥基自由基的強氧化作用可使染料體系降解，熒光強度減弱，實現Fenton體系中羥基自由基的熒光檢測。但此類熒光減弱型檢測方法的選擇性和重現性較差，不適合于復雜體系如紡織品前處理高溫氧漂工藝體系中羥基自由基的檢測。二甲基亞砜也為一種羥基自由基捕獲劑，有人采用分光光度法(潘光建，中國造紙學報，2006,21(3):41-47)和熒光光度法(谷學新，分析科學學報，2002,18(6):460-462)研究了二甲基亞砜(DMSO)捕捉羥自由基的反應，但反應步驟較長，定量檢測不準確。

另一類熒光增強型的常用捕獲劑為苯甲酸和對苯二甲酸，這類捕捉劑普遍被認為可與羥基自由基反應生成穩定的2-羥基苯甲酸，通過檢測羥基化產物的熒光可間接檢測羥基自由基的產生情況。苯甲酸首先被用于羥基自由基的熒光檢測，Vidrio等人利用苯甲酸熒光檢測環境中顆粒物導致的羥基自由基產生量(Vidrio,E.,et?al.,Environ.Sci.Technol.,2009,43,922-927)。檢測原理是苯甲酸本身沒有熒光，但在捕捉羥基自由基發生加成反應后，生成熒光性產物鄰羥基苯甲酸，通過檢測熒光強度，可間接測定羥基自由基。從分子結構上可以看出，苯甲酸分子中苯環上有5個反應位點，因此羥基自由基的加成反應沒有選擇性，但只有加成在鄰位的羥基化衍生物才會產生熒光。由于苯甲酸分子的不對稱結構，苯甲酸與羥基自由基加成反應也可得到不發熒光的間位和對位羥基化衍生物，也就是說發生了對熒光沒有貢獻的無效加成，這使得通過熒光強度測定并不能準確檢測羥基自由基，捕捉效率低。