[發(fā)明專利]新型RNAi前體及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310068534.3
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN104031916B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳立剛;尚仁福;徐蓓英
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/10;A61K48/00
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31266
• 代理人: 崔佳佳,馬莉華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及新型的RNAi前體及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是真核生物中由雙鏈小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)介導(dǎo)的RNA降解現(xiàn)象，最初在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn)，此后發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象在果蠅、擬南芥、斑馬魚和哺乳動物等多種真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用來特異性關(guān)閉靶基因的表達(dá)，具有極大的應(yīng)用價值。因此，自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，RNAi多次入選Science雜志評出的年度十大科學(xué)進(jìn)展，并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。2006年，Craig Mello和Andrew Fire因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象而被授予諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。目前大量生物技術(shù)公司和國際大制藥企業(yè)投資進(jìn)入RNAi技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域，其中針對呼吸道合胞體病毒感染(Respiratory syncytial virus infection)以及濕性年齡相關(guān)性黃斑變性病癥(Wet age-related macular degeneration)等幾種疾病的RNAi治療已進(jìn)入二期和三期臨床試驗。另外針對乙型肝炎(Hepatitis B)、實體瘤(solid tumors)以及先天性厚甲癥(Pachyonychia congenita)等疾病的RNAi藥物也已進(jìn)入一期或二期臨床試驗。

RNAi中的關(guān)鍵功能分子是長度約為21個核苷酸的siRNA，最初應(yīng)用時主要依靠化學(xué)方法合成，這種方法獲得的siRNA雖然能有效抑制目的基因的表達(dá)，但容易被細(xì)胞代謝清除，作用持續(xù)時間較短，且合成成本較高，每毫克siRNA的化學(xué)合成成本需要上千元。為了長期穩(wěn)定表達(dá)siRNA，研究人員設(shè)計開發(fā)出了由細(xì)胞內(nèi)自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)啟動子，如H1，U6等轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的shRNA(short hairpin RNA)。shRNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶Dicer進(jìn)一步加工后產(chǎn)生成熟的siRNA，發(fā)揮沉默靶基因表達(dá)的效果。這種基于RNA聚合酶Ⅲ的shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄效率高，且能在大多數(shù)種類的組織細(xì)胞中表達(dá)。構(gòu)建成病毒載體，比如慢病毒和腺病毒載體等后，可以用于感染原代細(xì)胞等用普通方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，從而達(dá)到沉默靶基因的目的。因此，shRNA載體技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，有多個公司開發(fā)了相應(yīng)的shRNA載體用于商業(yè)化應(yīng)用，這是通常所說的第一代RNAi載體技術(shù)。

RNAi已經(jīng)成為大多數(shù)生物和醫(yī)學(xué)實驗室日常都需要使用的技術(shù)，但目前使用的shRNA載體由于其自身特點而在實際應(yīng)用時存在一些缺點，主要包括：(1)效率不高。往往需要設(shè)計5個shRNA或siRNA才能保證有1-2個能對靶基因達(dá)到70％以上的抑制效果。(2)脫靶作用(off-target)嚴(yán)重。由于siRNA可以通過與mRNA部分互補(bǔ)配對(類似miRNA的作用方式)，從而非特異性抑制靶基因以外其它基因的表達(dá)。這種作用方式不只局限于Ago2蛋白，其它不具有切割活性的Argonaute蛋白，例如哺乳動物中的Ago1、3、4，也可以引起脫靶作用，并且siRNA中除了發(fā)揮功能的guide strand(引導(dǎo)鏈)以外，另一條互補(bǔ)鏈(稱為passenger strand，過客鏈)也會產(chǎn)生脫靶作用。(3)對細(xì)胞內(nèi)源miRNA具有較強(qiáng)的非特異性競爭作用。由于siRNA在加工成熟以及行使功能時，需要利用參與miRNA途徑的蛋白因子，比如Dicer，exportin-5以及Ago2等，所以必然會對內(nèi)源的miRNA產(chǎn)生競爭，影響內(nèi)源miRNA的正常加工和功能。研究表明，長期高表達(dá)shRNA會對成年小鼠肝臟造成損傷并致死【1】。

綜上所述，本領(lǐng)域急需毒副作用低，對靶基因的抑制效率高以及產(chǎn)生成熟siRNA效率高的RNAi載體，從而更好地應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病治療。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種可以引發(fā)RNA干擾（RNAi）的新型RNAi前體分子（saRNA，Single-stranded Ago2-processed interfering RNA）及其制備方法和應(yīng)用，所述RNAi前體對靶基因的抑制效率更高、脫靶作用更弱、毒性低，因此在研究基因功能和基因治療等方面具有極大潛力。

在第一方面，本發(fā)明提供一種RNAi前體，所述RNAi前體的核苷酸序列從5′端到3′端依次具有以下區(qū)域：

(a)5′端未配對區(qū)域，所述5′端未配對區(qū)域長度為1nt；