[發明專利]一種沙門菌熒光定量PCR檢測和分型的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201310068510.8
• 申請日: 2013-03-05
• 公開（公告）號: CN103114148A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 王成明;徐步;王志強;許傳靈;危藍菁;張繼壘
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及沙門菌分子診斷的熒光定量PCR檢測試劑和檢測方法。此發明有效擴增所有株的沙門菌（沙門菌二個種、腸道沙門菌的6個亞種）。此外，高分辨率熔解曲線技術方便地把沙門菌分成3組：i）重要的致病菌腸道亞種（熔解溫度69.5℃），ii）豪頓亞種（64.2℃）和雙亞利桑拉亞種（63.8℃），iii）邦戈爾沙門菌（54.8℃）、英迪加亞種（57℃）、薩拉姆亞種（55.5℃）、亞利桑那亞種（54.5℃）。?

背景技術

沙門菌（Salmonella?spp.）能引起人和動物多種不同臨床表現的沙門菌病，也是人類食物中毒的主要病因之一，對醫學、獸醫學和公共衛生學均十分重要。沙門菌屬分為腸道沙門菌(S.enterica)和邦戈爾沙門菌(S.bongori)。腸道沙門菌又分為6個亞種：腸道亞種（S.enterica?enterica簡寫為S.enterica）,薩拉姆亞種（S.salamae）,亞利桑那亞種（S.arizonae）,雙亞利桑那亞種（S.diarizonae）,豪頓亞種（S.houtanae）以及英迪加亞種（S.indica）。沙門菌感染的診斷主要依賴于細菌培養、血清凝集試驗以及分子診斷技術。但是,沒有單一的診斷方法可以方便地檢測和區分所有株的沙門菌（沙門菌二個種、腸道沙門菌的6個亞種）。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速、特異性強、靈敏度高、適合臨床使用的檢測所有株沙門菌的定量PCR檢測技術。同時基于高靈敏度熔解曲線技術方便的區分邦戈爾沙門菌和腸道沙門菌的不同亞種。?

本發明的原理和核心是科學地設計擴增和檢測沙門菌的特異、高效的引物和探針。在保證設計的引物高效擴增沙門菌、設計的探針特異檢測沙門菌的同時，確保此引物和探針不擴增和檢測其它類似的細菌。此外，設計的探針同沙門菌的堿基序列吻合程度不同；因此，高分辨率熔點曲線技術會顯示沙門菌的不同熔解溫度，這可以方便的用于基因分型。從GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）獲取如下沙門菌（種和亞種的代表株）以及相關細菌的ttrRSBCA的序列后，用Clustal?Multiple?Alignment?Algorithm的方法?對所有序列進行對齊：?

邦戈爾沙門菌,基因序列號,AY578066;?

腸道沙門菌薩拉姆亞種,基因序列號,AY578070;?

腸道沙門菌亞利桑那亞種,基因序列號,CP000880;?

腸道沙門菌雙亞利桑那亞種,基因序列號,AY578069.1;?

腸道沙門菌豪頓亞種,基因序列號,AY578068;?

腸道沙門菌英迪加亞種,基因序列號,AY578065）;?

腸道沙門菌腸道亞種的代表株:S.Gallinarum,基因序列號,AM933173;S.Enteritidis,基因序列號,AM933172;S.Weltevreden,基因序列號,FR775221;S.Paratyphi,基因序列號,CP000857;S.Typhi?LT2,基因序列號,AF282268;S.Dublin,基因序列號,CP001144。?

圖1、圖2、圖3、圖4顯示設計的引物和探針如下：?

上游引物：5’-GATGTTYCTTAGCGCYTTACAGGC-3’（SEQ?ID?NO.1）?

下游引物:5’-CCGACMGCGTAATATTTGGCTGAC-3’（SEQ?ID?NO.2）?

探針-1:5’-ATACGCTTTCCGGCACGGCAAT-6-FAM-3’（SEQ?ID?NO.3）?

探針-2:5’-LCRED640-CGTCRGTGGATTWCCGTCGCCCT-Phosphate-3’（SEQ?ID?NO.4）?

本發明還公開了沙門菌的熒光定量PCR檢測和分型試劑盒，包括包括5倍定量PCR反應液22μl,以及22μl的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5μM的上游引物、5μM下游引物、1μM的探針-1、1μM的探針-2。?

本發明進一步提供了沙門菌分型方法，該方法包括以下步驟：?

（1）用上述引物和探針PCR擴增待測樣本，擴增出210bp的條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為沙門菌陽性樣本；?