[發(fā)明專利]一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310068275.4
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN103145852A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 路凡;謝松濤;楊浩;沈琦;吳有盛;董海瑩;王莉;藥立波
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N15/12
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 汪人和

1.一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白，其特征在于，包括人多功能生長因子Pleiotrophin，在人多功能生長因子Pleiotrophin的N端還依次連接有純化標(biāo)記序列、凝血酶和腸激酶酶切位點，以及Nus序列。

2.如權(quán)利要求1所述的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白，其特征在于，所述的人多功能生長因子Pleiotrophin的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.如權(quán)利要求1所述的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白，其特征在于，所述的純化標(biāo)記序列為6×His的標(biāo)記序列。

4.如權(quán)利要求1所述的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白，其特征在于，所述的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

5.一種表達重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的原核表達載體，其特征在于，該原核表達載體為pET44a₍₊₎-Pleiotrophin，是通過EcoR?I/XHo?I酶切位點將如SEQ.ID.NO.3所示的人多功能生長因子Pleiotrophin基因片段，克隆入pET44a₍₊₎表達載體。

6.一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）以包含完整人Pleiotrophin基因編碼框的cDNA為模板，PCR擴增人Pleiotrophin基因片段；

2）將PCR擴增的人Pleiotrophin基因片段酶切后得到帶粘性末端的片段；并將該片段與同樣雙的pET44a₍₊₎載體連接，得到表達載體pET44a₍₊₎-Pleiotrophin；

3）將表達載體pET44a₍₊₎-Pleiotrophin轉(zhuǎn)染到感受態(tài)的大腸桿菌，篩選得到目的基因表達的陽性轉(zhuǎn)化子；

4）將陽性轉(zhuǎn)化子在37℃恒溫箱培養(yǎng)12h后挑取邊緣整齊、生長狀態(tài)良好的菌落，接種于含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，搖床37℃培養(yǎng)過夜；次日接種于新鮮的含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至細菌密度達到OD₆₀₀=0.4～0.6，加入0.2mM濃度的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2～4h，使得表達載體pET44a₍₊₎-pleiotrophin得到表達，然后離心收集細菌；

5）按5～10mL/g細菌沉淀的比例加入裂解液，重懸細菌，在冰浴下超聲裂菌，然后離心分離，并收集上清；

6）將收集的上清上樣于金屬螯合親和層析柱，用10倍柱體積的緩沖液A洗柱以0.5mL/min的流速洗脫，然后用2倍柱體積的緩沖液B洗柱，最后用緩沖液C洗脫結(jié)合蛋白，收集洗脫峰；

所述的緩沖液A為pH8.5、濃度20mmol/L的Tris·Cl，100mmol/L的KCl，5mmol/L的β-巰基乙醇和20mmol/L的咪唑的混合溶液；所述的緩沖液B為pH8.5、濃度20mmol/L的Tris·Cl，1mol/L的KCl和5mmol/L的β-巰基乙醇的混合溶液；所述的緩沖液C為pH8.5、濃度20mmol/L的Tris·Cl，100mmol/L的KCl，5mmol/L的β-巰基乙醇和100mmol/L的咪唑的混合溶液；

將收集的洗脫峰上樣于離子交換層析，用洗脫液D洗脫結(jié)合的蛋白，收集洗脫峰，得到純化的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白；

所述的洗脫液D為pH7.4、濃度50mmol/L的Tris·Cl和1mmol/L?NaCl的混合溶液。

7.如權(quán)利要求6所述的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述的PCR擴增人Pleiotrophin基因片段，是以引物對P作為引物，所述的引物對P為：

上游引物P1：aggaattcat?gcaggctcaa?cagtacc；

下游引物P2：agctcgagta?aatccagcat?cttctcc。

8.如權(quán)利要求6所述的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述的裂解液為pH8.5、濃度50mmol/L的Tris·Cl，5mmol/L的β-巰基乙醇和1mmol/L的PMSF的混合溶液。