[發明專利]一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 201310068275.4
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN103145852A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 路凡;謝松濤;楊浩;沈琦;吳有盛;董?，?/a>;王莉;藥立波
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N15/12
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及重組融合蛋白的表達，特別涉及一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白及其制備方法。

背景技術

多功能生長因子（pleiotrophin）是1989年由華盛頓大學醫學中心純化得到的一種生長因子，當時認為該因子為17kDa的蛋白，與肝素具有高度親和性，并首次被命名為HBGF-8(heparin．binding?growth?factor-8）。Ptn基因位于7q33-q34，長度大于100kb，編碼168個氨基酸，蛋白大小15.3kD，在SDS聚丙烯酰胺電泳表現為18kD。PTN正常表達于胚胎期，在成年的健康組織中很少表達，在大腦中表達水平最高，除此之外，還可表達于子宮、睪丸Leydig細胞等。PTN主要作用有：(1)對腫瘤的發生、生長與轉移、腫瘤血管生成有重要作用；(2)在中樞神經系統內對軸突生長、突觸生成、神經肌連接等有重要作用；(3)其他如促進有絲分裂、促進骨發育等作用；(4)促進造血干細胞擴增和及再生。因此pleiotrophin可作為營養支持多巴胺能神經元藥物，同時緩解帕金森病的癥狀，為帕金森病的治療提供一個新思路。

鑒于Pleiotrophin重要的生物學功能，獲得高純度有活性的Pleiotrophin蛋白，可作為營養支持多巴胺能神經元的基因藥物，具有應用于帕金森病治療的前景。而由于Pleiotrophin基因的mRNA二級結構復雜，不利于真核系統的外源表達；且單獨表達Pleiotrophin蛋白，由于表達量較小的原因，也會影響后期基因藥物的效率。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白及其制備方法，對Pleiotrophin基因進行了表達和純化，并驗證了該融合蛋白對神經經典細胞模型PC12細胞具有促進生長的活性。

本發明是通過以下技術解決方案來實現：

一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白，在人多功能生長因子Pleiotrophin結構域的N端還依次連接有純化標記序列、凝血酶和腸激酶酶切位點，以及Nus序列。

所述的人多功能生長因子Pleiotrophin的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的純化標記序列為6×His的標記序列。

所述的重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

一種表達重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的原核表達載體，該原核表達載體為pET44a₍₊₎-pleiotrophin，是通過EcoR?I/XHo?I酶切位點將如SEQ.ID.NO.3所示的人多功能生長因子Pleiotrophin基因片段，克隆入pET44a₍₊₎表達載體。

一種重組人多功能生長因子Pleiotrophin融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1）以包含完整人Pleiotrophin基因編碼框的cDNA為模板，以引物對P作為引物，PCR擴增人pleiotrophin基因片段，所述的引物對P為：

上游引物P1：aggaattcatgcaggctcaacagtacc；

下游引物P2：agctcgagtaaatccagcatcttctcc；

2）將PCR擴增的人pleiotrophin基因片段用EcoR?I/XHo?I雙酶切得到雙粘性末端的片段；并將該片段與EcoR?I/XHo?I雙酶切的pET44a₍₊₎載體連接得到表達載體pET44a₍₊₎-pleiotrophin；

3）將表達載體pET44a₍₊₎-pleiotrophin轉染到感受態的大腸桿菌，篩選得到目的基因表達的陽性轉化子；