[發明專利]抗CD20單克隆抗體可變區序列及其制備方法

有效

• 申請號: 201310066338.2
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN103173457A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 吳純;李靜文;鄒建炫;汪偉;楊春花;周延慶;李順玲;孫其玲;洪揚;陳媛
• 申請（專利權）人: 百奇生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C07K16/28;C12N15/10
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，更具體地，涉及抗CD20單克隆抗體可變區序列及其制備方法。

背景技術

CD20分子是人類B淋巴細胞表面特有的標識，在B淋巴細胞表面以寡聚體形式存在。CD20的結構與一些離子通道相似，每一個CD20單體都是4次跨膜，分子的N端和C端在細胞質的同側，可形成多聚體，CD20可在B淋巴細胞膜上形成鈣離子通道，CD20抗體在BCR的作用下，可形成鈣離子流。B細胞活化后，BCR—CD20復合物解離，磷蛋白、鈣調素結合蛋白會暫時被招募到CD20，從而參與胞內信號的傳導。

在人體中幾乎所有正常或惡性B淋巴細胞都存在CD20抗原。但是，其他血細胞如T淋巴細胞、NK細胞及粒細胞等不存在CD20抗原。因此，CD20抗原是單克隆抗體治療的一個理想的靶抗原。現在已經合成了一種針對CD20抗原的特異性抗體，稱為抗CD20，用于治療病情緩慢、侵襲性低的B細胞非霍奇金淋巴瘤，有效率達30％-50％。

人體對鼠源抗體具有免疫反應，這也是鼠源抗體應用于臨床治療的主要障礙。通過基因工程抗體技術可以在基因水平上改造抗體，降低鼠源抗體的免疫原性，提高抗體特異性、穩定性和親和力。對鼠源抗體進行人源化改造，可保留抗體可變區與人源抗體恒定區融合，提高抗體親和力；或改造抗體結構，構建只保留抗體可變區的scFv或含抗體可變區和部分恒定區的Fab,可提高抗體在體內的吸收百分比和半衰期。

發明內容

如上所述，抗CD20應用于B淋巴細胞瘤的臨床治療，療效顯著，毒副作用小，如今對抗CD20的分析研究越來越多，基于這一背景，本發明的目的是構建抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區的核苷酸序列和輕鏈可變區的核苷酸序列，同上提供制備上述核苷酸序列的方法。

為實現上述目的，本發明用CD20蛋白作為抗原來免疫小鼠，然后檢測出相應抗體表達呈陽性的小鼠，取表達呈陽性小鼠的脾臟，分離脾細胞，然后融合脾細胞和骨髓瘤細胞，得到雜交瘤細胞；在HAT培養基中培養后，檢測得到抗體表達陽性克隆，提取陽性雜交瘤細胞總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉錄得到相應抗體基因的cDNA，再通過PCR擴增獲得相應抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，由此實現本發明。

本發明提供了下述各項：

抗CD20單克隆抗體可變區序列，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為51802-VH和51802-VL。

優選的，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏號為407CT20.1.2的雜交瘤細胞株制備而成。

優選的，所述51802-VH編碼117個氨基酸，分子量為13273D，其中CDR1、CDR2和CDR3的區域分別為26aa-33aa,51aa-60aa和99aa-106aa。

優選的，所述51802-VL編碼113個氨基酸，分子量為12297D，其中CDR1、CDR2和CDR3的區域分別為27aa-37aa,55aa-57aa和94aa-102aa。

優選的，還包括與上述兩種核苷酸序列具有相同氨基酸序列產物的核苷酸序列。

優選的，還包括經過一個或者幾個堿基替換、缺失或添加后仍具有與所述核苷酸序列產生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。

制備抗CD20單克隆抗體可變區序列的方法，包括以下步驟：

（1）雜交瘤細胞的制備：首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑選出免疫后抗體表達呈陽性的小鼠，取其脾臟細胞，然后將分離的小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞；

（2）單克隆細胞的篩選：將上述雜交瘤細胞在HAT培養基中培養，對ELISA檢測呈陽性的單克隆細胞進行ELISA復篩，然后將篩選出的ELISA陽性單克隆細胞進行WB復篩，再將WB陽性細胞進行亞克隆，經過2次亞克隆，篩選出能夠穩定分泌抗體的單克隆細胞，將陽性的單克隆細胞擴大培養后定株、凍存；

（3）雜交瘤細胞抗CD20單克隆抗體的獲得：首先鑒定步驟（2）所制備的單克隆細胞的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細胞注射到小鼠體內進行腹水生產，再將產生的腹水通過層析純化后得到抗CD20單克隆抗體；

（4）抗CD20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因的克隆：提取步驟（3）中所用的單克隆細胞的總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉錄得到cDNA，最后克隆得到抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。