[發明專利]抗CD20單克隆抗體可變區序列及其制備方法

有效

• 申請號: 201310066338.2
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN103173457A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 吳純;李靜文;鄒建炫;汪偉;楊春花;周延慶;李順玲;孫其玲;洪揚;陳媛
• 申請（專利權）人: 百奇生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C07K16/28;C12N15/10
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

1.抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為51802-VH和51802-VL。

2.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏號為407CT20.1.2的雜交瘤細胞株制備而成。

3.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，所述51802-VH?編碼?117?個氨基酸，分子量為?13273D，其中CDR1、CDR2?和?CDR3?的區域相應地分別為?26aa-33aa,?51aa-60aa?和?99aa-106aa。

4.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在在于，所述51802-VL?編碼?113?個氨基酸，分子量為?12297D，其中?CDR1、CDR2?和?CDR3?的區域相應地分別為?27aa-37aa,55aa-57aa?和?94aa-102aa。

5.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，還包括：與上述兩種核苷酸序列具有相同氨基酸序列產物的核苷酸序列。

6.根據權利要求5所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，還包括：經過一個或者幾個堿基替換、缺失或添加后仍具有與所述核苷酸序列產生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。

7.制備權利要求1至6任意一項所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）雜交瘤細胞的制備：首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑選出免疫后抗體表達呈陽性的小鼠，取其脾臟細胞，然后將分離的小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞；

（2）單克隆細胞的篩選：將上述雜交瘤細胞在HAT培養基中培養，對ELISA檢測呈陽性的單克隆細胞進行ELISA復篩，然后將篩選出的ELISA陽性單克隆細胞進行WB復篩，再將WB陽性細胞進行亞克隆，經過2次亞克隆，篩選出能夠穩定分泌抗體的單克隆細胞，將陽性的單克隆細胞擴大培養后定株、凍存；

（3）雜交瘤細胞抗CD20單克隆抗體的獲得：首先鑒定步驟（2）所制備的單克隆細胞的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細胞注射到小鼠體內進行腹水生產，再將產生的腹水通過層析純化后得到抗CD20單克隆抗體；

（4）抗CD20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因的克隆：提取步驟（3）中所用的單克隆細胞的總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉錄得到cDNA，最后克隆得到抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。