[發明專利]一種N-乙酰葡萄糖胺異構酶在生產N-乙酰甘露糖胺中的應用

有效

• 申請號: 201310065854.3
• 申請日: 2013-03-01
• 公開（公告）號: CN103088090A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 應漢杰;季雯燕;謝婧婧;孫梧進;陳勇;陳曉春;吳菁嵐
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12P19/24;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種N-乙酰葡萄糖胺異構酶(N-acetylglucosamine?2-epimerase，AGE)的應用，尤其涉及一種來自海藻Prochlorococcus?marinus?str.MIT9215中的N-乙酰葡萄糖胺異構酶（PmAGE）在以N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）為底物生產N-乙酰甘露糖胺（N-acetyl-D-mannosamine,ManNAc）中的應用。

背景技術

N-乙酰甘露糖胺（N-acetyl-D-mannosamine,ManNAc）是一種重要的中間體，可用于抗流感藥物前體及嬰幼兒奶粉添加劑N-乙酰神經氨酸（N-acetyl-D-neuraminic?acid,Neu5Ac）的合成。

以N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）為底物用于合成ManNAc，再以ManNAc和丙酮酸為底物經N-乙酰神經氨酸縮合酶（N-acetylneuraminic?acid?lyase,Nal）催化合成N-乙酰神經氨酸是目前最主要的合成Neu5Ac的途徑。而把廉價的底物GlcNAc經異構反應生成其昂貴的同分異構體ManNAc是兩步反應中的關鍵步驟。

迄今為止關于催化GlcNAc合成ManNAc的反應已有許多報道。概括起來主要有化學法和生物催化法。

化學催化法是在強堿性的條件下將GlcNAc異構成ManNAc，但是該方法對下游的底物及酶具有強烈的降解作用，因而不適合大規模應用[1]。

生物催化法采用AGE在溫和的條件下催化GlaNAc生成ManNAc，因而避免了化學法中強堿對下游反應的抑制作用。但是AGE只存在在自然界極少的幾個物種中。目前報道的AGE主要集中在哺乳動物，如豬[2]、人[3]、老鼠[4]；以及淡水藻，如Synechocystis?sp.PCC6803[5]和Anabaena?sp.CH1[6]中；以及卵形擬桿菌Bacteroides?ovatus?ATCC8483[7]中。這些AGE的共同的特點是需要ATP作為激活劑。全細胞催化法可以克服反應體系中添加ATP的需要[8]，但其缺陷是細胞膜降低了底物的傳質造成反應速率降低，而且全細胞催化劑無法長期穩定地重復利用。與此相反，通過酶的固定化方式進行ManNAc生產可以克服底物的傳質作用而且酶可以長期重復利用，但是卻需要添加高成本的ATP[9]。本專利中研究的AGE可以在不需要添加ATP的情況下表現出很高的酶活，從而很好地解決了酶催化法合成ManNAc中的瓶頸。

本專利中涉及到的N-乙酰葡萄糖胺異構酶（PmAGE）是AGE的一種，其包含384個氨基酸，其在Genbank中的收錄號為YP_001484631.1，（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/YP_001484631.1），其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。編碼該蛋白的基因含有1155bp堿基，其在Genbank中的收錄號為NC_009840.1，(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009840.1?report=genbank&from=1224454&to=1225608)，其基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。至今未發現PmAGE用于ManNAc合成的報道。

【參考文獻】：

[1]Blayer?S,Woodley?JM,Dawson?MJ,Lilly?MD(1999)Alkaline?biocatalysis?for?the?direct?synthesis?of?N-acetyl-D-neuraminic?acid(Neu5Ac)from?N-acetyl-D-glucosamine(GlcNAc).Biotechnol?Bioeng66：131-136。

[2]Itoh?T,Mikami?B,Maru?I,Ohta?Y,Hashimoto?W,Murata?K（2000）Crystal?structure?of?N-acyl-D-glucosamine2-epimerase?from?porcine?kidney?at2.0A?resolution.J?Mol?Biol?303:733-44。