[發(fā)明專利]一種N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶在生產(chǎn)N-乙酰甘露糖胺中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310065854.3
• 申請(qǐng)日: 2013-03-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103088090A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)漢杰;季雯燕;謝婧婧;孫梧進(jìn);陳勇;陳曉春;吳菁嵐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/26
• 分類號(hào): C12P19/26;C12P19/24;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶在催化N-乙酰葡萄糖胺合成N-乙酰甘露糖胺中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶為催化劑，以N-乙酰葡萄糖胺為底物，不需要ATP作為輔因子，制備N-乙酰甘露糖胺。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，表達(dá)基因序列如SEQ?ID?NO：1所示的重組菌，經(jīng)過(guò)破碎與鎳柱純化后，將純酶與N-乙酰葡萄糖胺在緩沖液中反應(yīng)得到N-乙酰甘露糖胺。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，基因序列如SEQ?ID?NO：1所示的重組菌的構(gòu)建方法如下：以Prochlorococcus?marinus?str.MIT9215基因組為模板擴(kuò)增出N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶的基因并連接到pET-28a載體上，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli?Rosetta(DE3)中。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，重組菌的表達(dá)方法如下：培養(yǎng)重組菌至OD₆₀₀=0.8時(shí)添加0.5mM?IPTG，在15℃、220rpm條件下誘導(dǎo)12h。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，鎳柱純化條件為：60mM咪唑溶液洗脫雜蛋白，500mM咪唑溶液洗脫純酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，純酶與N-乙酰葡萄糖胺的反應(yīng)比為0.2-20U的純酶與50-200mM?N-乙酰葡萄糖胺反應(yīng)。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的緩沖液為pH7～8.5的磷酸緩沖液或pH7～8.5的Tris-HCl緩沖液。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，純酶與N-乙酰葡萄糖胺在緩沖液中反應(yīng)條件為：溫度35～38℃，反應(yīng)時(shí)間0.2～2h。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，純酶與N-乙酰葡萄糖胺在緩沖液中反應(yīng)條件為：溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間0.5h。