[發明專利]一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒

無效

• 申請號: 201310065400.6
• 申請日: 2013-03-01
• 公開（公告）號: CN103197058A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 李亮;徐華莉;王旻子;張明洲;魏建良;程曄
• 申請（專利權）人: 杭州迪恩科技有限公司
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544;G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于酶聯免疫檢測技術領域，具體涉及一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒。

背景技術

呋喃西林(Nitrofurazone)等硝基呋喃類抗生素因其廣譜、高效、廉價等特點被廣泛應用于家畜、家禽、水產、蜂等動物傳染疾病的預防和治療。氨基脲(SEM)是呋喃西林的代謝產物，它在此類藥物中毒性最強，在動物源性食品中的殘留可通過食物鏈傳遞給人類，長期攝入有致畸胎、致癌等副作用。美國、日本和歐盟目前已全面規定禁止使用呋喃類抗菌物質。我國農業部文件農牧發[2002]1號也規定動物源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的檢出限為不得檢出。

呋喃西林在動物體內很快代謝，其中常以檢測其代謝產物作為殘留標示，目前歐盟對硝基呋喃類代謝物的檢測方法靈敏度規定為1ug/kg。已報道用于檢測硝基呋喃類抗生素代謝物殘留的方法主要有HPLC、LC-MS、LC-MS/MS和酶聯免疫法(ELISA)等。

HPLC、LC-MS、LC-MS/MS等方法靈敏度高、準確性好，常作為藥物殘留檢測的確認方法，在我國LC-MS/MS技術更是被作為此類藥物在動物源性食品中檢測的國標法。然此類方法對儀器和操作人員要求都較高，一個樣品檢測要幾百元，檢測時間也很長，不能滿足現場抽檢的需求和推廣應用。ELISA技術以其快速、靈敏、特異性高等特點已成為目前藥品殘留檢測的有效方法之一。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有高靈敏度、特異性、準確度、精確度且操作簡單的酶聯免疫吸附檢測試劑盒，用于定量快速檢測蜂蜜、各種水產畜禽組織生物樣品中的呋喃西林代謝物，以及飼料中的原型藥。

一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒，該試劑盒包括：呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標板、呋喃西林代謝物辣根過氧化物酶標記物、呋喃西林代謝物標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和樣品稀釋液。

所述的清洗液為0.05％-0.5％吐溫-20磷酸鹽緩沖液。

所述的顯色劑為過氧化氫；或者過氧化脲、鄰苯二胺與穩定劑K按5∶5∶1(體積比)混合而成；或者過氧化脲、四甲基聯苯胺與穩定劑K按5∶5∶1(體積比)混合而成；在4℃下可以穩定保存兩年不變色。

所述的酶標物稀釋液為含酶穩定劑AH和酶保護劑KEN的磷酸鹽緩沖液。

所述的穩定劑K、含酶穩定劑AH和酶保護劑均購自美國International?Diagostica?System公司。

所述呋喃西林代謝物酶標記物為濃縮液，使用時用酶標物稀釋液溶解為工作液即可直接使用。

所述的呋喃西林代謝物標準品用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L，pH7.4)配置成濃度分別為0ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.45ng/mL、1.35ng/mL、4.05ng/mL的溶液。

所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。

所述的濃縮樣品稀釋液為含1％BSA的5倍濃縮磷酸鹽緩沖液。

所述呋喃西林代謝物特異性抗體包被在酶標板上。

所述呋喃西林代謝物特異性抗體為動物抗呋喃西林代謝物的多克隆抗體，用呋喃西林代謝物與載體蛋白偶聯物作為免疫原通過免疫動物制得。

所述動物為兔、鼠或羊。

一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的方法，按照如下步驟進行：

(1)樣品前處理：對于肌肉、肝臟、魚、蝦的組織，供試樣用均質器均質樣本，取1.0±0.05g的均質物進行以下操作；對于蜂蜜樣品直接稱取1.0±0.05g的供試樣進行以下操作；

(2)加入4mL蒸餾水，0.5mL1M鹽酸和150μL50mM的4-硝基苯甲醛溶液，渦旋混勻30s，60℃水浴3h，每隔1h渦旋振蕩一次；

(3)加入5mL0.1M磷酸氫二鉀和0.4mL1M氫氧化鈉溶液，混勻加入6mL乙酸乙酯，振蕩1-40min，室溫條件下，4000g離心10min，收集3mL上層液體至10mL玻璃試管，50～60℃水浴氮氣吹干；