[發(fā)明專(zhuān)利]一種從光帽鱗傘中提取的抗腫瘤蛋白及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310064869.8
• 申請(qǐng)日: 2013-03-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103102399A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉方;張業(yè)尼;劉趙昆
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南開(kāi)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/375
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/375;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16;A61P35/00
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從光帽鱗傘（Pholiota?nameko，俗名：滑子菇）中提取的抗腫瘤蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)，蘑菇作為中藥或功能性食品，在食品和醫(yī)藥行業(yè)備注關(guān)注。從蘑菇中分離獲得的許多活性成分，包括小分子、多糖、蛋白、多糖-蛋白復(fù)合物等，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物和免疫調(diào)節(jié)的作用。其中，有關(guān)多糖的研究最為廣泛，然而，蘑菇中含量豐富的生物活性蛋白，包括凝集素，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，核糖體失活蛋白，抗微生物蛋白，核糖核酸酶和漆酶等，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用上展現(xiàn)出巨大的潛能。

光帽鱗傘（Pholiota?nameko）屬真菌門(mén)，擔(dān)子菌綱，傘菌目，球蓋菇科，鱗傘屬。它是一種冬、春季發(fā)生的菌蓋粘滑的木腐菌，因其菌蓋表面有粘液而又被稱(chēng)為滑子菇，是世界上五大宗人工栽培的優(yōu)質(zhì)食用菌之一。

光帽鱗傘（Pholiota?nameko）具有滑、鮮、嫩、脆的特點(diǎn)，富含有益于人體健康的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、礦物元素（鈣、磷、鐵）、維生素（維生素B₁、B₂、維生素C、煙酸）以及人體所必須的其他各種氨基酸等營(yíng)養(yǎng)保健物質(zhì)，是一種低熱量的保健食品。據(jù)分析，每100g干菇含粗蛋白33.76g、純蛋白15.13g、脂肪4.05g、總糖38.89g、纖維素14.23g、灰分8.99g。除食用價(jià)值外，也具有一定的藥用價(jià)值。其子實(shí)體含豐富的多糖，能夠提高機(jī)體的免疫力。

目前，除了對(duì)光帽鱗傘（Pholiota?nameko）生長(zhǎng)特性，栽培技術(shù)的研究外，對(duì)其生物活性的研究主要集中在多糖上，而對(duì)其中含量豐富的生物活性蛋白研究尚淺。周蕊等（南京林業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文2007）從Pholiota?nameko菌絲發(fā)酵液中分離純化得到分子量為55KDa的漆酶。Yasuko?Kawamura-Konishi等(Biosci.Biotechnol.Biochem.,71(7):1752-1760)從Pholiota?nameko子實(shí)體中分離純化得到酪氨酸蛋白酶，分子量約為42KDa。Gui-Ping?Guan等（Journal?of?Bioscience?and?Bioengineering2011,111(6)：641-645）從Pholiota?nameko子實(shí)體中分離純化得到絲氨酸蛋白酶，分子量約為19KDa。漆酶可用于降解木質(zhì)素，酪氨酸蛋白酶主要用于環(huán)境治理包括含有酚類(lèi)的廢水和污染的土壤的處理。而本發(fā)明首次從Pholiota?nameko中分離純化得到一種新的具有抗腫瘤活性的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供光帽鱗傘（Pholiota?nameko）中的一種抗腫瘤蛋白及其制備方法，該蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF7的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

本發(fā)明提供的從光帽鱗傘（Pholiota?nameko）中提取的抗腫瘤蛋白，分子量為17KDa，N-端氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示序列Ala?Gly?Arg?Thr?Phe?Ile?Gly?Tyr?Asn?Gly，該抗腫瘤蛋白簡(jiǎn)稱(chēng)為PNAP（Pholiota?nameko?Anti-tumor?protein）。

本發(fā)明涉及的光帽鱗傘（Pholiota?nameko）中的抗腫瘤蛋白是按照如下方法制備的：

（1）將光帽鱗傘（Pholiota?nameko）子實(shí)體研磨成粉，溶解于0.2~0.5M的NaCl溶液，2~6℃浸提8~16小時(shí)，5000~8000rpm離心20~40min，收集上清液，即光帽鱗傘Pholiota?nameko子實(shí)體粗提液；

（2）向步驟（1）中的光帽鱗傘（Pholiota?nameko）子實(shí)體粗提液中加入硫酸銨至飽和度為70~100%，2~6℃放置8~16小時(shí)，10000~20000rpm離心10~40min，收集沉淀，即光帽鱗傘Pholiota?nameko蛋白粗提物；

（3）將步驟（2）中的光帽鱗傘（Pholiota?nameko）蛋白粗提物用20~50mM、pH6.0~9.0的PBS緩沖液溶解，然后在2~6℃、1~5倍重量的蒸餾水中透析8~16小時(shí)，反復(fù)3~5次，透析后進(jìn)行冷凍干燥，即光帽鱗傘（Pholiota?nameko）蛋白粗粉；