[發明專利]eIF3a突變基因及其檢測引物、試劑盒、檢測方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒

在審

• 申請號: 201310063846.5
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103224938A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 劉昭前;王瑛;郭成賢;尹繼業;陳娟
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明屬于醫學分子生物學領域，具體涉及eIF3a突變基因及其擴增引物、試劑盒、擴增方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒和該質粒的制備方法。?

背景技術

真核生物翻譯調控主要發生在起始階段，也是翻譯的限速階段。這一過程有10個以上的翻譯起始因子(eukaryotic?initiation?factors，eIFs)參與。eIF3是翻譯起始因子中最大，最復雜的一個，它由13個亞基組成，分別命名為eIF3a到eIF3m，它參與翻譯起始的所有步驟。首先，參與80S核糖體解離，eIF3可以與40S核糖體亞基結合并形成復合物，從而使其保持解離狀態不與60S亞基聚合。第二，eIF3參與了43S翻譯起始前復合物的形成，它與40S亞基結合后，協助招募GTP-eIF2-tRNA-methionine三聚復合物。第三，eIF3幫助mRNA與43S翻譯起始前復合物結合。此外，它也參與了翻譯起始復合物對起始密碼子的識別和通過與內部核糖體進入位點(Internal?Ribosome?Entry?Site,IRES)結合參與帽狀結構非依賴性翻譯起始過程。eIF3a是eIF3最大的亞基，我們前期的研究表明它可以調控一些蛋白的合成，包括α-tubulin、核苷酸還原酶M2(Ribonucleotide?Reductase?M2,RRM2)和p27等。我們已有的研究證明了eIF3a可以調控一些NER途徑的蛋白翻譯。?

我們前期的研究中測序篩查到新的SNPs:eIF3a2554G>A，它位于10號染色體外顯子（Arg803Lys），導致了有義突變。我們在前期的研究表明，eIF3a可以調控某些細胞周期和增殖分化相關基因的表達。我們試圖探討eIF3a2554G>A基因突變是否能通過調控eIF3a的表達而影響其下游基因的表達。因此需要構建eIF3a2554G>A突變型eIF3a真核表達載體。?

發明內容

本發明旨在克服現有技術的不足，提供eIF3a突變基因及其擴增引物、試劑盒、擴增方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒和該質粒的制備方法。?

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：?

一種eIF3突變基因，其基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

一種檢測上述突變基因的試劑盒，所述試劑盒包括如下引物：?

前引物：5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’（SEQ?ID?NO.2）；?

后引物：5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’（SEQ?ID?NO.3）。?

試劑盒中其他試劑為常規PCR擴增試劑，測序試劑。?

一種擴增上述突變基因的方法：從質粒pcβa-eIF3a的全長cDNA上擴增出突變基因并測序，pcβa-eIF3a基因序列如SEQ?ID?NO.7所示；擴增體系為：5×Primer?star?Buffer20μL，dNTP?mix8μL，前引物2μL，后引物2μL，cDNA2μL，Primer?STAR1μL，加ddH₂O65μL至終體積100μL；擴增條件為：95℃預變性5min，98℃10s，58℃退火15s，72℃2min共30個循環，72℃總延伸10min；所述前引物和后引物分別如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。?

一種pcβa-eIF3a-Arg438Cys突變型質粒，所述質粒包括eIF3突變基因，所述質粒的核酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。?

一種制備pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒的方法，包括如下步驟：?

（1）從質粒pcβa-eIF3a的全長cDNA上擴增出含2554G>A位點的DNA片段Arg803Lys，pcβa-eIF3a基因序列如SEQ?ID?NO.7所示；擴增引物為：?

前引物：5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’（SEQ?ID?NO.2）；?

后引物：5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’（SEQ?ID?NO.3）；?