[發明專利]eIF3a突變基因及其檢測引物、試劑盒、檢測方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒

在審

• 申請號: 201310063846.5
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103224938A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 劉昭前;王瑛;郭成賢;尹繼業;陳娟
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

1.一種eIF3突變基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種擴增權利要求1所述突變基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物：

前引物：5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’；

后引物：5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’。

3.一種擴增權利要求1所述突變基因的方法，其特征在于，所述方法為：

從質粒pcβa-eIF3a的全長cDNA上擴增出突變基因并測序，pcβa-eIF3a基因序列如SEQ?ID?NO.7所示；擴增體系為：5×Primer?star?Buffer?20μL，dNTP?mix8μL，前引物2μL，后引物2μL，cDNA2μL，Primer?STAR?1μL，加ddH2O65μL至終體積100μL；擴增條件為：95℃預變性5min，98℃10s，58℃退火15s，72℃2min共30個循環，72℃總延伸10min；所述前引物和后引物分別為權利要求2中所述的前引物和后引物。

4.一種pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒，其特征在于，所述質粒包括權利要求1所述的突變基因，所述質粒的核酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

5.一種制備權利要求4所述pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒的方法，包括如下步驟：

（1）從質粒pcβa-eIF3a的全長cDNA上擴增出含2554G>A位點的DNA片段Arg803Lys；擴增引物為：

前引物：5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’；

后引物：5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’；

擴增體系為：5×Primer?star?Buffer?20μL，dNTP?mix8μL，前引物2μL，后引物2μL，cDNA2μL，Primer?STAR1μL，加ddH2O65μL至終體積100μL；擴增條件為：95℃預變性5min，98℃10s，58℃退火15s，72℃2min共30個循環，72℃總延伸10min；

（2）將步驟（1）的擴增的Arg803Lys用乙醇沉淀，然后在Arg803Lys末端加A尾；

（3）采用切膠法回收經步驟（2）處理的Arg803Lys；

（4）將Arg803Lys與pGEM-T?easy載體連接后轉化至DH5α高效率感受態細胞，于LB/氨芐平板上37℃過夜培養，再挑單克隆培養后提取質粒，然后用ApaI酶切驗證連接質粒；（5）定點誘變構建pGEM-T?easy-Arg803Lys突變型載體：

PCR擴增體系：10*reaction?buffer?5μL，pGEM-T?easy-Arg803Lys?1μg，前引物5’-GGCAGCGTAAAGAAGAACGCAAGATAACATACTATAGAGAAA-3’1μL，后引物5’-TTTTCTCTATAGTATGTTATCTTGCGTTCTTCTTTACGCTGCC-3’1μL，dNTP?mix1μL，Quik?Solution?reagent1.5μL，ddH2O加至50μL，最后加1μL?Quik?change?Enzyme；

熱循環：96℃2min，96℃20s，60℃10s，68℃2min共20個循環。最后68℃延伸5min；

將PCR產物經DpnⅠ消化后轉化至XL10-Gold超級感受態細胞，涂布LB/氨芐平板，37℃下培養后挑單克隆培養，提取質粒，即為pGEM-T?easy-Arg803Lys突變型載體；

（6）分別將pGEM-T?easy-Arg803Lys突變型載體和pcβa-eIF3a進行MluI和BspDI雙酶切，將pcβa-eIF3a雙酶切后不含2554G>A位點的DNA片段與pGEM-T?easy-Arg438Cys酶切后含2554G>A位點的DNA片段進行連接，然后將連接產物用BL21感受態細胞進行轉化，涂LB/氨芐平板篩選，挑單克隆LB培養基培養并提取質粒，即得pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質粒。