[發明專利]無固定點靶物質的適配體篩選方法

有效

• 申請號: 201310063844.6
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103114147A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 周培;吳遠根;詹深山;王法澤;劉樂;邢海波;詹學佳
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種無固定點靶物質的適配體篩選方法，其特征在于，通過構建隨機寡核苷酸文庫以及用于PCR擴增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文庫引物，并利用鏈霉親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用于克隆測序的PCR產物，經測序后得到與無固定點靶物質特異親和性結合的適配體；

所述的隨機寡核苷酸文庫的序列為：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’，其中：兩端分別為Seq?ID?No.1和Seq?ID?No.2所示的19bp的固定序列，中間30個堿基為隨機序列；

所述的上游引物，即P1序列，如Seq?ID?No.1所示；

所述的下游引物，即P2序列，如Seq?ID?No.3所示；

所述的固定寡核苷酸文庫引物，即P3序列，為5’-Biotin-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’其中：P3序列由Biotin和Seq?ID?No.3所示的下游引物序列組成。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的固定寡核苷酸文庫是指：將含有隨機寡核苷酸文庫與含有固定寡核苷酸文庫引物的水溶液混合后進行退火處理，然后將將退火后的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的混合是指：以摩爾比為1:2～3的比例混合。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的退火處理是指：在94°C環境下變性60s；然后在59°C環境下退火60min；再在25°C環境下延伸5min，其中：退火過程及延伸過程的降溫速度為0.1°C/s。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的固定寡核苷酸文庫在SELEX方法篩選前經緩沖液充分洗滌，離心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的SELEX方法是指：依次進行若干輪的正向SELEX篩選和反向SELEX篩選。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征是，所述的正向SELEX篩選是指：向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒加入無固定點靶物質，經孵育后離心處理并收集離心液，作為非對稱PCR擴增的模板，經PCR程序擴增后收集產物并純化，作為后續正向篩選用文庫，使得無固定點靶物質濃度降低。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征是，所述的正向SELEX篩選的次數為以無固定點靶物質濃度降低至標準檢出限以下時終止，并進行反向SELEX篩選。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征是，所述的反向SELEX篩選是指：當靶物質為某種重金屬離子，則向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒先加入與無固定點靶物質性質或結構類似的不同的重金屬離子，孵育后離心處理并去除離心液，然后加入無固定點靶物質，孵育后離心處理并收集離心液，作為PCR擴增寡核苷酸的模板，經PCR程序擴增后收集產物并純化，作為后續反向篩選的文庫。

10.根據權利要求6或9所述的方法，其特征是，所述的反向SELEX篩選的次數為3～5次。