[發明專利]無固定點靶物質的適配體篩選方法

有效

• 申請號: 201310063844.6
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103114147A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 周培;吳遠根;詹深山;王法澤;劉樂;邢海波;詹學佳
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種分析化學核酸適配體篩選技術領域的方法，具體涉及一種利用鏈霉親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，并通過SELEX技術篩選無固定點靶物質的適配體的方法。

背景技術

SELEX(Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment，即指數富集配體系統體外進化)技術是20世紀90年代初發展起來的一種新的組合化學技術。利用該技術可以從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選到特異性與靶物質高度親和的核酸適配體。其基本思路是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，與靶物質混合，形成靶物質-核酸復合物，洗脫未結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進入下輪的篩選。通過重復的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的核酸分子被洗去，而與靶物質有強親和力的核酸分子從非常大的隨機庫中分離出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，最后占據庫的大多數(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異核酸適配體后，經過十幾年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研究手段和工具。

SELEX過程中的關鍵步驟是將未結合的核酸與能與靶物質結合的核酸分開。大多數研究者選擇將靶物質固定，當單鏈寡核苷酸庫與靶物質混合，能與靶物質結合的核酸分子隨著靶物質一起留在固定介質上后，洗去不能結合的核酸。通過固定靶物質的方法，人們運用SELEX技術已成功篩選到包括有機染料、藥物、氨基酸、細胞因子、輔因子、氨基糖苷、氨基類似物、核苷酸和多肽等物質的適配體。但運用該方法的前提是靶物質有固定點，因此有關無固定點靶物質適配體的篩選少見報道。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種無固定點靶物質的適配體篩選方法，通過固定寡核苷酸文庫，洗脫未固定的核酸，正向篩選時加入靶物質與固定的核酸作用，洗脫下能與靶物質結合的核酸分子，PCR擴增后用于下一輪篩選；反向篩選時加入與靶物質性質或結構類似的物質，洗脫除去與靶物質非特異性結合的核酸分子。經過多輪次的正、反向篩選，得到能與靶物質高特異性、強親和力作用的核酸適配體。將本方法應用于重金屬鎘離子適配體的篩選，得到13條能與鎘離子高特異性、強親和力作用的適配體。本發明固定效果好、適用性強且成本低，可用于無固定點靶物質的適配體篩選。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過構建隨機寡核苷酸文庫以及用于PCR擴增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文庫引物，并利用鏈霉親和素標記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用于克隆測序的PCR產物，經測序后得到與無固定點靶物質特異親和性結合的適配體。

所述的隨機寡核苷酸文庫的序列為：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’，

其中：兩端分別為Seq?ID?No.1和Seq?ID?No.2所示的19bp的固定序列，中間30個堿基為隨機序列。

因30個堿基中每個堿基有4種可能組成，故此隨機寡核苷酸文庫理論庫容量為4³⁰，理論上可從中篩選出任何靶物質的適配體。

所述的上游引物，即P1序列，如Seq?ID?No.1所示，為5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’；

所述的下游引物，即P2序列，如Seq?ID?No.3所示，為5’-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’；

所述的固定寡核苷酸文庫引物，即P3序列，為

5’-Biotin-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’

其中：P3序列由Biotin（生物素，與鏈霉親和素有很強作用力）和Seq?ID?No.3所示的下游引物序列組成。

所述的固定寡核苷酸文庫是指：將含有隨機寡核苷酸文庫與含有固定寡核苷酸文庫引物的水溶液混合后進行退火處理，然后將將退火后的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。

所述的混合是指：以摩爾比為1:2～3的比例混合。

所述的退火處理是指：在94°C環境下變性60s；然后在59°C環境下退火60min；再在25°C環境下延伸5min，其中：退火過程及延伸過程的降溫速度為0.1°C/s。