[發明專利]復合材料固定化赤霉菌制備煙酸的方法

有效

• 申請號: 201310063189.4
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103103228A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 史勁松;李恒;楊濤;龔勁松;許正宏;孫文敬;周強
• 申請（專利權）人: 江南大學;江西省德興市百勤異VC鈉有限公司
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C12N11/10;C12N11/08;C12R1/645
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技術領域

本發明涉及一種利用復合材料固定化產腈水解酶的赤霉菌CA3-1（Gibberella?intermedia，CGMCC?No.4903）制備煙酸的方法，屬于生物工程應用技術領域。

背景技術

煙酸的生產主要是采用化學合成法和生物催化法，目前在工業上，仍然主要采用化學合成的方法進行生產，如高錳酸鉀氧化法、硝酸氧化法、氣相氧化法、臭氧氧化法、氨氧化法、電解氧化法等，合成條件苛刻，如高溫高壓，能耗較大，易產生大量的廢氣廢渣等，而且合成效率較低，普遍存在著污染大、工藝復雜、成本高等缺點。違背了現價段可持續發展戰略和建設環境友好型社會的要求，不符合原子經濟性和綠化化學的發展方向。

生物法生產煙酸條件溫和，催化效率較高，對環境的影響小，反應過程易于控制，底物選擇性強，與化學合成法相比，生物法制備煙酸具有非常大的優勢，適合現代應用于工業化生產。腈水解酶具有極為廣泛的底物譜，這也使得其在食品、制藥、化工等領域有很好的應用前景，利用腈水解酶降解腈類化合物制備有機酸必將成為未來化工生產中的一個不可或缺的工藝。從已有研究成果來看，腈水解酶在腈類化合物中的轉化應用具有較高潛力，研究其細胞固定化過程和固定化細胞的轉化工藝具有重要的理論意義和應用價值。

游離細胞與固定化細胞相比，固定化細胞的轉化活力因受到固定化過程的影響而有所降低，但固定化細胞的優勢在于：固定化細胞容易回收重復利用，有利于產物的分離純化，而且降低了生產成本，提高了單位利用效率。因此，選擇合適的固定方法和固定化材料制備殘留活性高、能多次重復利用、儲存和操作穩定性好的固定化細胞前景值得期待。

腈類物質對于產腈水解酶的微生物來說，都會有或強或弱的毒性。微生物細胞經過固定化后，被包埋在生物材料里面，避免了與腈類化合物的直接接觸，減弱了腈類化合物毒性對微生物的傷害，使微生物細胞能夠長時間的保存轉化能力。產腈水解酶的微生物在固定化以后，能夠增強對產物和底物的耐受性，提高持續轉化能力。

復合材料固定化細胞的優勢在于，不同的材料混合使用，集合不同材料的優勢，彌補單一材料的不足。單一材料固定化時，固定化細胞難以同時兼有良好機械強度和高的殘留活力。將具有較高活力的固定化材料和具有較好機械強度的固定化材料復合使用，這樣的復合材料就比較好的解決了這個的問題。本專利采用殼聚糖-聚乙烯醇復合材料固定化赤霉菌CA3-1，既彌補了殼聚糖固定化小球機械強度差的劣勢，也彌補了聚乙烯醇固定化小球活力低的缺點。

至今為止，從未有利用復合材料固定化產腈水解酶的絲狀真菌并且用于腈類化合物生物轉化的任何專利及文獻報道。而目前國內在這方面的研究仍處于空白。

發明內容

本發明目的是提供一種復合材料固定化赤霉菌CA3-1（Gibberella?intermedia，CGMCC?No.?4903）制備煙酸的方法。該菌株為赤霉菌（Gibberella?intermedia）CA3-1，保藏在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.4903，保藏日期為2011年5月24日。

本發明的技術方案為：赤霉菌CA3-1通過液體培養獲得菌液，經過離心分離獲得濕菌體，用生理鹽水離心洗滌數次后重懸于生理鹽水中，加入聚乙烯醇和殼聚糖的混合包埋材料溶液，混合均勻后用注射器平穩的注入到多聚磷酸鈉和飽和硼酸混合固化溶液中固化，得到的固定化小球經過濾、用PBS洗去表面未固定的細胞和固化溶液。取定量的固定化小球參與反應，加入PBS緩沖液，加底物3-氰基吡啶，在一定溫度、一定pH值的條件下反應一定時間后，得到產物煙酸。

上述過程中，赤霉菌CA3-1的液體培養基（g/L）為：磷酸二氫鉀2.72，硫酸亞鐵0.0139，葡萄糖10，酵母粉7.5，氯化鈉1.16，己內酰胺3.39，pH值為7.0。培養條件為：500mL三角瓶裝50mL培養基在30℃，220rpm，往復式搖床振蕩培養60h。離心分離所得菌體重懸于生理鹽水中，獲得10g/L的菌懸液，聚乙烯醇的質量分數為5%，殼聚糖溶液的質量分數為4%，多聚磷酸鈉的質量分數為10%，在0℃固化時間8h。形成的固定化小球用紗布過濾，用PBS緩沖液洗滌。轉化反應時，PBS緩沖液的加入量為7mL，pH值為9.0，底物3-氰基吡啶的濃度為100mM?7mL，溫度為40℃，反應時間為30min。

具體實施方式

下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。

實例一