[發(fā)明專利]一種單核苷酸多態(tài)性分析方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310062203.9
• 申請(qǐng)日: 2013-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN104004821A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭安亮;姚見兒;王方金;劉榴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海透景生命科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外診斷核酸分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性分析方法。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(Single?nucleotide?polymorphism，SNP)，是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。SNP在人類基因組中廣泛存在，大概每1000個(gè)堿基就有一個(gè)SNP。SNP是人類遺傳學(xué)變異中最常見的一種。絕大多數(shù)疾病的發(fā)生與環(huán)境因素和遺傳因素的綜合作用有關(guān)，通常認(rèn)為是在個(gè)體具有遺傳易感性的基礎(chǔ)上，環(huán)境有害因素作用而導(dǎo)致疾病。不同群體和個(gè)體對(duì)疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學(xué)性狀(如對(duì)藥物的反應(yīng)性等)有差別，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是SNP，占所有已知多態(tài)性的90%以上。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，人們愈來愈相信基因組中的SNP有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)疾病，特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性以及對(duì)各種藥物的耐受性和對(duì)環(huán)境因子的反應(yīng)。因此，尋找和研究SNP已成為人類基因組計(jì)劃的內(nèi)容和目標(biāo)之一。繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩個(gè)遺傳標(biāo)記之后，成為第三代分子標(biāo)記。

SNP具有數(shù)量多，分布廣及高度穩(wěn)定性，適于快速、規(guī)模化篩查，易于基因分型等特點(diǎn)，很適合對(duì)復(fù)雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識(shí)別等方面的研究。SNP檢測(cè)在分子診斷、臨床檢驗(yàn)、法醫(yī)學(xué)、病原檢測(cè)、遺傳疾病和新藥研發(fā)等方面凸顯出越來越重要的價(jià)值。

SNP檢測(cè)技術(shù)發(fā)展很快，出現(xiàn)了許多SNP檢測(cè)技術(shù)。大致可以分為以下幾種：(1)測(cè)序方法：Sanger雙脫氧測(cè)序，焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)，SNaPshot微測(cè)序；(2)基于雜交的方法：Taqman探針法，DNA芯片法；(3)熔解曲線：高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High?Resolution?Melt，HRM)；(4)引物延伸：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix?Assisted?Laser?Desorption?Ionization?Time?of?Flight，MALDI-TOF)；(5)變性高效液相色譜技術(shù)(Denaturing?High?Performance?Liquid?Chromatography，DHPLC)；(6)以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(Restriction?Fragment?Length?Polymorphism，RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(Single?Strand?Conformation?Polymorphism，SSCP)，變性梯度凝膠電泳法(Denaturing?Gradient?Gel?Electrophoresis，DGGE)。

各種不同的檢測(cè)方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)，以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法目前已很少使用，Sanger測(cè)序是SNP檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，能發(fā)現(xiàn)已知SNP，也能發(fā)現(xiàn)未知SNP；缺點(diǎn)是每個(gè)樣本的每個(gè)位點(diǎn)均需要經(jīng)PCR擴(kuò)增，跑膠，然后切膠純化，再測(cè)序，步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長(zhǎng)，價(jià)格昂貴，不適合大樣本多位點(diǎn)檢測(cè)。微測(cè)序方法(SNaPshot)類似普通測(cè)序，10個(gè)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物同時(shí)引物延伸，通量增加；劣勢(shì)在于每個(gè)樣品的每個(gè)位點(diǎn)都需要PCR預(yù)先擴(kuò)增，跑膠，割膠，DNA純化。10個(gè)位點(diǎn)可以同時(shí)測(cè)序，提高了測(cè)序效率，但對(duì)延伸引物要求極高，如每個(gè)引物有4-6個(gè)堿基差異，不能有互補(bǔ)區(qū)段，還要相同條件延伸，除廠家已經(jīng)驗(yàn)證的少數(shù)位點(diǎn)外，很難自己設(shè)計(jì)針對(duì)新位點(diǎn)的檢測(cè)。多個(gè)分散步驟，費(fèi)錢費(fèi)時(shí)，易出錯(cuò)。基于雜交的方法包括實(shí)時(shí)熒光Taqman探針檢測(cè)和DNA芯片法，只能檢測(cè)已知SNP位點(diǎn)，不能同時(shí)發(fā)現(xiàn)未知SNP，Taqman探針法的通量低，DNA芯片法的準(zhǔn)確性低，需重復(fù)驗(yàn)證。MALDI-TOF和DHPLC優(yōu)點(diǎn)是快捷、所需樣標(biāo)本量極少，MALDI-TOF適宜于已經(jīng)優(yōu)化的特定SNP檢測(cè)，不適宜該服務(wù)從未做過的新SNP檢測(cè)。DHPLC可判斷有否突變，不能確定SNP的位置和類型，需用標(biāo)準(zhǔn)樣品或結(jié)合測(cè)序驗(yàn)證。