[發明專利]一種慢病毒載體及其病毒顆粒的制備和應用

無效

• 申請號: 201310062193.9
• 申請日: 2013-02-27
• 公開（公告）號: CN103290056A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 葉軍;陳海旭
• 申請（專利權）人: 上海諾百生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 胡美強;沈利

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種慢病毒載體及其病毒顆粒的制備和應用。

背景技術

慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發展起來的基因導入載體，在現代生物醫學研究中受到越來越多的關注。近年來開始應用于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加。

慢病毒系統目前市場上最有影響力的系統分別是由Invitrogen公司（近期改為Life?Technologies）和Clontech公司推出的系統。Invitrogen公司的HiPerform系統包含一個表達質粒和三個包裝質粒，表達質粒以pLenti6.3/V5-DEST（見圖1）為代表；三個包裝質粒分別為pLP1，pLP2和pLP/VSVG。采用該表達載體時，目的基因需要通過重組反應導入載體，包裝時采用三個包裝質粒和表達載體共轉染的方法，以lipofectamine2000為轉染試劑導入293T細胞（ATCC#CRL-11268），經36-48小時收獲病毒顆粒。該系統在構建表達載體時，需要兩種重組酶-即BP重組酶和LR重組酶，這兩種酶價格昂貴，并且對溫度敏感，因而重組效率常常不穩定。

Clontech公司的慢病毒系統在載體構建時雖然較為簡單，但是包裝過程中使用該公司研發的轉染試劑，價格昂貴，很難進行規模生產。

為使慢病毒系統達到既能快速構建載體，又能以價格低廉的轉染試劑進行制備，我們建立了一套慢病毒載體及病毒包裝系統，克服了上述缺陷，并且取得了很好的制備病毒顆粒的效果。

發明內容

本發明目的是提供一種慢病毒載體以及將完成亞克隆的該載體包裝成慢病毒顆粒的一種方法，該載體無需進行重組反應，使用酶切連接的方法可以進行亞克隆，該方法使用價格低廉的化學試劑即可完成，并且制得病毒顆粒滴度高、活性好，在侵染目的細胞中達到很好的效果。

本發明的技術方案如下：

本發明的技術方案之一是：一種慢病毒載體，其以慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST為骨架，將慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位點之間的片段替換為多克隆位點片段，并且按轉錄方向在該多克隆位點片段的3’端插入IRES-GFP片段。

其中，優選的，所述的多克隆位點（MCS）依次為：BamHI，PacI，NheI，AscI，SwaI，PmeI。

在設計多克隆位點時，充分評估了載體上其它序列信息，加上6個單一酶切位點：BamHI，PacI，NheI，AscI，SwaI，PmeI，有利于用簡單的酶切、連接的方法進行克隆。優選的，所述的多克隆位點片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發明所述IRES-GFP片段是指由內部核糖體進入位點（IRES）和綠色熒光蛋白（GFP）的編碼序列組成的核苷酸片段。更優選的，所述IRES-GFP片段是以pIRES2-EGFP載體（購自Clontech公司）為模板，由上游引物和下游引物經過PCR擴增而制得的，其中上游引物的序列為如SEQ?ID?NO.4所示，下游引物的序列如SEQ?ID?NO.5所示。

本發明以慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST為出發載體，插入了多克隆位點和IRES-GFP片段。慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位點之間的片段中含有用于重組的元件，因此，本發明將慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位點之間的片段替換為多克隆位點即刪除了用于重組的元件。

本發明的慢病毒載體，能更高效的表達目的基因，同時又有GFP蛋白為示蹤，克服了原來載體中沒有GFP示蹤蛋白的缺陷。

本發明的技術方案之二是：一種將所述的慢病毒載體包裝成慢病毒顆粒的方法，包括以下步驟：

1）在水中加入所述的慢病毒載體，包裝質粒pLP1，pLP2和pLP/VSVG（購自Invitrogen公司）以及CaCl₂溶液，然后逐滴加入2×HBS，混勻后靜置，得磷酸鈣-DNA沉淀溶液；

2）再將步驟1）所得磷酸鈣-DNA沉淀溶液加入到含有胰酶消化尚未貼壁的293T細胞的細胞培養基中，培養后收集病毒。

優選的，步驟1）中，所述的慢病毒載體的用量是15-20μg/1000μl，CaCl₂的用量是124mM，2×HBS的加入量是50%（v/v）。