[發明專利]一種慢病毒載體及其病毒顆粒的制備和應用

無效

• 申請號: 201310062193.9
• 申請日: 2013-02-27
• 公開（公告）號: CN103290056A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 葉軍;陳海旭
• 申請（專利權）人: 上海諾百生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 胡美強;沈利

1.一種慢病毒載體，其特征在于，其以慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST為骨架，將慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位點之間的片段替換為多克隆位點片段，并且按轉錄方向在該多克隆位點片段的3’端插入IRES-GFP片段，所述的多克隆位點依次為：BamHI，PacI，NheI，AscI，SwaI，PmeI，所述IRES-GFP片段是以pIRES2-EGFP載體為模板，由上游引物和下游引物經過PCR擴增而制得的，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

2.如權利要求1所述的慢病毒載體，其特征在于，所述的多克隆位點片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

3.一種將權利要求1所述的慢病毒載體包裝成慢病毒顆粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）在水中加入所述的慢病毒載體，包裝質粒pLP1，pLP2和pLP/VSVG以及CaCl₂溶液，然后逐滴加入2×HBS，混勻后靜置，得磷酸鈣-DNA沉淀溶液；

2）再將步驟1）所得磷酸鈣-DNA沉淀溶液加入到含有胰酶消化尚未貼壁的293T細胞的細胞培養基中，培養后收集病毒。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1）中，所述的慢病毒載體的用量是15-20μg/1000μl，CaCl₂的用量是124mM，2×HBS的加入量是50%，所述百分比是體積百分比。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1）中，所述靜置為2分鐘，然后立即將磷酸鈣－DNA懸液逐滴加入所述的293T細胞的細胞培養基中，輕輕搖動混勻。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述的含有胰酶消化尚未貼壁的293T細胞，細胞密度為：每100mm培養皿6-8×10⁶細胞數。

7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述的培養為在37℃CO₂培養箱中溫育，8-16小時換新鮮細胞培養基，繼續培養24小時后，收集病毒。

8.如權利要求3所述的方法制備慢病毒顆粒。

9.如權利要求8所述的慢病毒顆粒在基因克隆或表達中的應用。