[發明專利]一種分離純化重組蛋白A的方法有效

申請號：	201310061920.X	申請日：	2013-02-27
公開（公告）號：	CN103145813A	公開（公告）日：	2013-06-12
發明（設計）人：	陳校園;余波光;張海珍;周彤	申請（專利權）人：	廣州康盛生物科技有限公司
主分類號：	C07K14/31	分類號：	C07K14/31;C07K1/14;C07K1/20
代理公司：	珠海智專專利商標代理有限公司 44262	代理人：	許淑文
地址：	510660 廣東省廣州***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種分離純化重組蛋白方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，尤其涉及重組蛋白A的純化及內毒素的去除方法。?

背景技術

金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcus?aureus?Protein?A，SPA）是金黃色葡萄球菌細胞壁的組成成分。SPA能與人及多種哺乳動物的血清IgG分子中的Fc片段特異性結合，因此已經被廣泛用于抗體的分離純化，以及在臨床上用于治療抗體相關性疾病。?

由于蛋白A的用途廣泛，市場需求量日益增加。僅從金黃色葡萄球菌中直接提取天然蛋白，不僅無法滿足市場需求而且這種獲取蛋白A的方法復雜性高；金黃色葡萄球菌是致病菌，大規模生產危險性大，容易發生治病物質殘留等一系列問題。因此近年來人們開始轉向基因工程的方法來生產重組蛋白A。由于使用的基因工程菌-大腸桿菌含大量的內毒素，因此生產的重組蛋白A極易受到內毒素污染；而對于蛋白A用于抗體藥物的純化生產或臨床治療而言，內毒素的危害都是顯而易見的。因此，對于蛋白A的分離純化而言，不僅要求達到較高的純度，還要嚴格控制內毒素的含量。?

目前，重組蛋白A的分離純化主要有如下幾種：a)一步法，即通過一步凝膠篩分（CN?1432578A,CN?1524957A等）、一步鎳離子螯合層析（CN?101050464A）或一步親和層析（CN?101921818A）獲得目的產物；b)多步法，包括采用親和層析—陰離子交換層析兩步法（US?5075423A）、疏水層析—陽離子交換層析兩步法（US6555661B1）和熱處理—離子交換層析—乙醇沉淀三步法（US?5314993?A）。?

國內專利申請所公開的重組蛋白A的純化方法均未涉及到內毒素去除的效果。對凝膠篩分法而言，由于處理量小、速度慢，而且無法去除內毒素，因而根本無法用于蛋白A的工業化生產。而對于親和層析、離子交換層析和金屬離子螯合層析等的純化方法，為去除內毒素，必須使用大量的含表面活性劑的緩沖液（體積為層析介質體積的十幾倍至幾十倍）沖洗層析介質，這不僅很不環保，而且在沖洗過程中由于蛋白A的脫吸附而極大的影響回收率，特別是在介質經多次使用而性能下降時，蛋白A的損失尤為明顯。另外，層析介質一般價格昂貴、穩定性不高（如鎳離子螯合層析介質、親和層析介質等）；并且在實際生產蛋白A的兩個批次之間，必須使用NaOH或鹽酸胍等對介質進行在位清洗和消毒，這也會加速層析介質的性能下降、使用壽命縮短。這些因素都使得采用層析的純化方法成本較高。綜上所述，目前在工業上使用的蛋白A純化方法主要存在回收率較低或成本高的缺點。?

另一方面，眾所周知的是，活性炭可以吸附內毒素，卻很難用于去除蛋白溶液中的內毒素，原因是在去除內毒素的同時，活性炭也能吸附蛋白質，導致回收率很低。因此若要使用活性炭去除蛋白溶液中的內毒素，必須解決蛋白回收率的問題。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種成本低、回收率高、適于工業化生產的蛋白A分離純化方法，以解決目前的蛋白A純化方法存在的回收率較低或成本高的問題，同時解決活性炭吸附過程中蛋白回收率低的問題。?

本發明所述的蛋白A或重組蛋白A是指全長或僅含其中某個或某些結構域的蛋白A基因經克隆、轉化、并在大腸桿菌細胞內表達得到的重組蛋白質。?

本發明所采用的技術方案是：?

一種重組蛋白A分離純化的方法，它包括如下步驟：

（1）菌體懸浮液加熱處理；

（2）對步驟（1）所得破碎上清第一次活性炭吸附；

（3）對步驟（2）所得上清溶液第二次活性炭吸附；

特別地，還包括：

（4）將步驟（3）獲得的蛋白A溶液上樣至已用緩沖液平衡的疏水相互作用層析柱，收集穿流峰，得精純蛋白A溶液。

具體地，其步驟如下：?