[發明專利]一種大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法無效

申請號：	201310061722.3	申請日：	2013-02-27
公開（公告）號：	CN103149315A	公開（公告）日：	2013-06-12
發明（設計）人：	胡良海;劉喜東;孫嚴彤;楊艷;顧景凱	申請（專利權）人：	吉林大學
主分類號：	G01N30/88	分類號：	G01N30/88
代理公司：	長春吉大專利代理有限責任公司 22201	代理人：	王恩遠
地址：	130012 吉***	國省代碼：	吉林;22
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種大鼠 cyp450 酶質譜絕對定量方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于蛋白質組學的技術領域，涉及一種同時測定大鼠5種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法。

背景技術

藥物進入體內后可經過代謝過程以一種或多種有活性或無活性的代謝產物形式排出體外。由于遺傳多態性及表觀遺傳的因素，使得作用于藥物代謝過程的酶有明顯的種族差異和個體差異。因此，藥物代謝酶的定性和定量分析對于藥物開發，評價藥物的代謝過程以及研究藥物-藥物相互作用具有重要的參考價值和意義。目前，用于酶定量分析的方法主要包括探針藥物法、Western?bLotting法、2-D電泳法和mRNA檢測法，但這些方法都存在著一定的不足。例如，CYP450酶家族屬于同工酶，其底物常常具有交叉現象，很難找到CYP450酶絕對專一的探針藥物，至今只有極少數CYP450酶底物的專一性得到了全面的驗證；CYP450酶特別是亞家族內同工酶序列存在高度同源性，這為Western?bLotting法中所需特異性抗體的制備和純化提出了很高的要求；2-D電泳法，操作連續性強，勞動密集，而且不能用于CYP450膜結合蛋白的分析；由于蛋白質的表達受到多種機制的調控，利用mRNA表達的水平代表其對應的蛋白含量并不十分可靠。這些方法的最大的不足是專屬性差，無法區分同源性很高的如CYP2B1和CYP2B2等CYP450酶亞型；并且定量時僅能給出相對含量的信息，而酶的絕對含量對于評價其生物學意義是十分重要的。因此，建立一種藥物代謝酶亞型絕對定量方法是十分必要的。

與本發明相近的現有技術是CN102175804的發明專利申請。涉及的是測定人的CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法；在蛋白樣品預處理中沒有進行固相萃取和濃縮復溶，影響檢測的定量準確性。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，建立一種可以同時測定大鼠的5種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法。涉及的CYP450酶亞型是CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2。

本發明采取的技術方案是，選取經胰酶水解CYP450酶獲得的特異性肽段，其中特異性是指肽段只由其相對應的CYP450酶經胰酶水解產生，其他蛋白質經胰酶水解并不能產生該肽段?；谝合嗌V-串聯質譜（LC/MS/MS）技術，利用多重反應監測（MRM）模式對特異性肽段進行掃描分析，建立特異性肽段穩定、可靠的LC/MS/MS定量方法。所測得特異性肽段濃度經由蛋白濃度校正獲得CYP450酶亞型絕對含量。采取上述方法即可實現利用正常肽段定量CYP450酶亞型水平。正常肽段即是待測肽段。

本發明的具體技術方案如下所述。

一種大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法，涉及5種CYP450酶亞型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2；過程有蛋白樣品預處理，標準曲線制備，最后進行蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定；

所述的蛋白樣品預處理，有如下5步驟，

（1）蛋白樣品的還原，

于聚乙烯管中加入100μL大鼠肝微粒體樣品；

加入50mg固體變性劑，渦流溶解混勻，所述的固體變性劑，是尿素；

加入10μL?pH緩沖液，渦流混勻，所述的pH緩沖液，是500mM的碳酸氫氨溶液；

加入4μL還原劑，渦流混勻，所述的還原劑，是300mM的二硫蘇糖醇溶液；

37℃孵育1小時，得到反應液；

（2）半胱氨酸的封閉，

于反應液中加入12μL半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育40min；所述的半胱氨酸封閉劑，是300mM的碘乙酰胺溶液；

（3）肝微粒體樣品的胰酶消化，