[發明專利]一種大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法

無效

• 申請號: 201310061722.3
• 申請日: 2013-02-27
• 公開（公告）號: CN103149315A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 胡良海;劉喜東;孫嚴彤;楊艷;顧景凱
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 王恩遠

1.一種大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法，涉及5種CYP450酶亞型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2；過程有蛋白樣品預處理，標準曲線制備，最后進行蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定；

所述的蛋白樣品預處理，有如下5步驟，

（1）蛋白樣品的還原，

于聚乙烯管中加入100μL大鼠肝微粒體樣品；

加入50mg固體變性劑，渦流溶解混勻，所述的固體變性劑，是尿素；

加入10μL?pH緩沖液，渦流混勻，所述的pH緩沖液，是500mM的碳酸氫氨溶液；

加入4μL還原劑，渦流混勻，所述的還原劑，是300mM的二硫蘇糖醇溶液；

37℃孵育1小時，得到反應液；

（2）半胱氨酸的封閉，

于反應液中加入12μL半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育40min；所述的半胱氨酸封閉劑，是300mM的碘乙酰胺溶液；

（3）肝微粒體樣品的胰酶消化，

經半胱氨酸封閉的反應液中加入400μL消化緩沖液，再加入20μL胰酶溶液，渦流混合，37℃孵育12~16h得到肝微粒體樣品反應液，后13000g離心5min得肝微粒體樣品酶解反應上清溶液；所述的消化緩沖液，是50mM的碳酸氫氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液；

（4）肝微粒體樣品酶解反應液的固相萃取，

于固相萃取柱中加入1mL甲醇溶液，至液體自然流完；

于固相萃取柱中加入1mL洗脫溶液，至液體自然流完；

于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液體自然流完，兩遍洗；

取肝微粒體樣品酶解反應上清溶液，至液體自然流完；

于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液體自然流完，三遍洗；

于固相萃取柱中加入1mL洗脫溶液，至液體自然流完，得肝微粒體樣品洗脫液，置于聚乙烯管中；

所述的洗脫溶液，是按體積比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按體積比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；

（5）肝微粒體樣品洗脫液的濃縮、復溶，

將肝微粒體樣品洗脫液真空離心蒸干，加入100μL去離子水，渦流混勻，得到肝微粒體樣品復溶液；

所述的標準曲線制備，是

利用去離子水將特異性肽段標準品溶解至5μg/μL，得到特異性肽段儲備液；

利用去離子水將特異性肽段儲備液分別稀釋至50、100、300、1000、3000、10000pg/μL；

取20μL進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，以特異性肽段濃度為橫坐標，特異性肽段峰面積為縱坐標，用加權W=1/x²最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為標準曲線；

所述的蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定，是

取肝微粒體樣品復溶液20μL進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，將肽段峰面積代入標準曲線，求得肽段濃度，此肽段濃度即為對應CYP450酶亞型濃度；經樣品蛋白濃度校正，即將CYP450酶亞型濃度除以蛋白濃度，得到蛋白樣品中CYP450酶亞型含量；

在標準曲線制備及蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定過程中，

色譜條件為：LC-20ADXR?SHIMADZU型液相色譜系統；色譜柱：peptide?C18柱，50mm×2.1mm?I.D.，5μm粒徑；流動相：甲酸體積百分數占0.1%的水和甲酸體積百分數占0.1%的乙腈，梯度洗脫；柱溫40℃；流速0.5mL/min；進樣量20μL；所述的梯度洗脫程序，過程如下表所示：

其中A是甲酸體積百分數占0.1%的水溶液，B是甲酸體積百分數占0.1%的乙腈混合溶液；

質譜條件為：Qtrap?5500型線性離子阱液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源和AnaLyst?1.5數據處理軟件；離子源：電噴霧離子化源；正離子方式檢測；離子噴射電壓5000V；溫度500℃；源內氣體1：氮氣壓力45psi；氣體2：氮氣壓力45psi；氣簾氣體：氮氣壓力25psi；掃描方式為多重反應監測。

2.根據權利要求1所述的大鼠CYP450酶質譜絕對定量方法，其特征在于，樣品測定期間利用質量控制樣品對方法進行驗證；所述的質量控制樣品按照如下步驟制備：

①利用去離子水將特異性肽段標準品溶解至5μg/μL，得到特異性肽段儲備液；

②利用去離子水將特異性肽段儲備液分別稀釋至100、1000、3000pg/μL；

③標準肽段每濃度取三個樣本，根據標準曲線，得出標準肽段濃度，計算質量控制樣品準確度。